本文選題：傳染性法氏囊病病毒　切入點：miRNA　出處：《南京農業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的一種高度危害養(yǎng)雞業(yè)的傳染病。天然免疫(innate immunity)是機體防御病原體感染的第一道防線,在啟動機體的獲得性免疫應答中起著十分重要的作用。microRNA (miRNA)是一種21-25nt的小分子RNA,是基因表達的調控子,本研究以IBDV為模式病毒,探討了miRNA在機體中調控干擾素、p53和模式識別受體抗IBDV天然免疫的分子機制。1傳染性法氏囊病病毒對雞法氏囊組織中干擾素和p53轉錄的影響為了分析傳染性法氏囊病病毒(IBDV)感染雞體內干擾素和p53轉錄水平差異變化,用IBDV弱毒(B87)和強毒(QL/12)分別感染4周齡SPF雞,每隔12h時(12～84h)取3只雞的法氏囊組織混合勻漿,用熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測其感染前后干擾素(IFN)和p53的mRNA水平,同時分析法氏囊組織的病理變化和病毒載量。結果顯示:QL/12組,IFN-αα和IFN-β mRNA水平隨著時間的增加逐漸升高,48h達到峰值,隨后降低;IFN-γ mRNA水平隨著時間的增加逐漸升高,60h達到峰值,隨后逐漸降低;p53 mRNA含量迅速升高,60h達到峰值(比正常SPF雞高約90倍),隨后降低。B87組,IFN-αmRNA水平先降低后升高(48h達到最低值),而IFN-β mRNA水平變化不規(guī)則,72h含量最高;IFN-y mRNA水平先逐漸升高后降低(72h達到峰值);p53 mRNA含量變化較小,36h含量最高(比正常SPF雞高約5倍);QL/12組誘導法氏囊組織產(chǎn)生的 IFN mRNA (IFN-α、IFN-β 和 IFN-γ mRNA)以及 p53 mRNA 水平均顯著高于B87-IBDV組。病理組織學檢查可見:與正常對照組相比,QL/12組法氏囊淋巴濾泡呈不同程度的損傷,B87組法氏囊組織未見明顯的組織病變。qRT-PCR檢測IBDV病毒載量,QL/12組法氏囊組織中病毒含量48h達到峰值(8.4×106copies/mg),而B87組法氏囊組織中病毒含量72h達到峰值(6.6×104copies/mg)。本研究為分析雞體內IFN和p53介導的抗IBDV天然免疫中的作用奠定了基礎。2雞p53抑制傳染性法氏囊病病毒復制及gga-miR-2127對其調控機制傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的一種高度危害養(yǎng)雞業(yè)的傳染病。腫瘤抑制蛋白p53能夠抑制多種病毒的復制,但對IBDV復制的影響仍然不清楚。本研究以IBDV為模式病毒,采用體外感染模式,在IBDV感染的DF-1細胞中,p53的表達水平和活性均顯著升高。p53過表達可以抑制IBDV的復制,并激活雞體抗病毒天然免疫基因(IPS-1、IRF3、PKR、OAS、Mx)的表達水平上調;p53抑制表達則得到相反的結果;表明p53可以激活雞體的抗病毒天然免疫反應發(fā)揮抗IBDV感染作用。用生物信息學方法和雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)gga-miR-2127可以作用于p53的3'UTR; qRT-PCR和免疫印跡分析表明gga-miR-2127可以使p53的蛋白水平表達降低,但mRNA水平?jīng)]有變化;gga-miR-2127過表達可以使雞體的抗病毒天然免疫基因表達降低,IBDV復制水平升高。本研究表明:gga-miR-2127可以作用于p53的3'UTR調控p53的表達來發(fā)揮抗IBDV感染的作用。3 gga-miR-9*靶向IRF2促進傳染性法氏囊病病毒復制的分子機制為研究gga-miR-9*對傳染性法氏囊病病毒(IBDV)復制的影響,本研究用化學合成的方法合成gga-miR-9*的模擬物gga-miR-9*mimics,轉染DF-1細胞,24 h后,接種IBDV, 48 h后,收集細胞培養(yǎng)上清液,測定IBDV的滴度,結果顯示,gga-miR-9* mimics能夠促進IBDV的復制。通過對病毒感染后的IFN檢測分析,發(fā)現(xiàn)gga-miR-9*可負調控干擾素(IFN)的產(chǎn)生;進一步用生物信息學方法和雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析驗證,gga-miR-9*可靶向調控干擾素調控基因2(IRF2)。用 western blot 和 qRT-PCR 分析,gga-miR-9* mimics 轉染的 DF-1 細胞中IRF2蛋白和mRNA水平均比正常DF-1細胞顯著降低,將細胞中的IRF2基因敲除,IBDV復制滴度((106 25TCID50/0.1mL))顯著高于miRNA對照組((105 25TCID50/0.1mL)),表明細胞gga-miR-9*促進IBDV復制的分子作用機理是在IRF2基因轉錄后水平上抑制細胞天然免疫功能而發(fā)生的。4傳染性法氏囊病病毒感染對雞細胞模式識別受體及抗病毒基因轉錄的影響為研究傳染性法氏囊病病毒(IBDV)感染對雞細胞模式識別受體(PRRs)及天然免疫抗病毒基因轉錄的影響,本實驗分別用IBDV弱毒感染DT40細胞和強毒感染SPF雞,以定量PCR (qRT-PCR)檢測感染細胞和法氏囊組織中PRRs(TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、MDA5 和 LGP2)及天然免疫抗病毒基因(IPS-1、IRF3、PKR、OAS、Mx)的mRNA轉錄變化。在IBDV感染DT40細胞的2h到 24h 內,chMDA5、chTLR3、chLGP2、IRF3、PKR、OAS、Mx 的轉錄水平顯著上升,分別為 324、22、61、29、16、225 000 和 18 700 倍。當用 siRNA 分別敲除 DT40 細胞中 chMDA5、chTLR3 和 chLGP2 時,IPS-1、IRF3、PKR、OAS和Mx在IBDV感染后的2h到24h差異變化不顯著。在IBDV感染SPF雞法氏囊組織細胞中,chMDA5和chTLR3的表達顯著降低,而chLGP2表達沒有顯著差異,IRF3、PKR、OAS和Mx的轉錄水平顯著上升。TLR4和TLR7在IBDV的體外和體內感染試驗中均未檢測到,而IPS-1在IBDV的體外和體內感染試驗中均變化不顯著。本實驗結果表明,chMDA5、chTLR3和chLGP2在識別IBDV的感染中起著關鍵作用,IBDV感染嚴重抑制了雞細胞模式識別受體chMDA5和chTLR3的轉錄,并且提示其抑制作用在體內與體外可能存在不同的分子機制。5 gga-miR-142-5p調控chMDA5抑制傳染性法氏囊病病毒復制的機制傳染性法氏囊病是由傳染性法氏囊病病毒引起的一種高度危害養(yǎng)雞業(yè)的傳染病。chMDA5在識別病原相關分子模式(PAMPs)及激活宿主的天然免疫應答中具有重要的作用,但chMDA5識別IBDV的分子機制仍然不清楚。本研究以IBDV為模式病毒,采用體外感染模式,在IBDV感染的DT40細胞中,chMDA5的表達水平顯著升高。chMDA5過表達可以抑制IBDV的復制,并激活IFN-β promoter和Mx promoter活性,chMDA5抑制表達則得到相反的結果;且chMDA5激活IFN-β promoter活性主要是通過IRF7通路;表明chMDA5可以激活雞體的抗病毒天然免疫反應發(fā)揮抗IBDV感染作用。用生物信息學方法和雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)gga-miR-142-5p可以作用于chMDA5的3'UTR; qRT-PCR和免疫印跡分析表明gga-miR-142-5p可以使chMDA5的蛋白水平表達降低,但mRNA水平?jīng)]有變化;gga-miR-142-5p過表達可以使IFN-β promoter和Mx promoter活性降低;IRF7通路被抑制,而NF-κB通路無影響,IBDV復制水平升高。本研究表明:gga-miR-142-5p可以作用于chMDA5的3'UTR調控chMDA5的表達從而影響其下游IFN-β promoter和Mx promoter活性來發(fā)揮抗IBDV感染的作用。
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【學位授予單位】：南京農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31

【參考文獻】

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本文編號：1567167