本文選題：STING　切入點：啟動子　出處：《南京醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景:固有免疫反應是機體抵抗病毒感染的第一道防線,在抗病毒免疫過程中具有關鍵作用。干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)是抗DNA病毒信號通路中重要的接頭蛋白,還可作為模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)直接識別cAMP、cGMP等參與抗胞內菌感染,此外STING還參與抗RNA病毒的免疫,并在抗腫瘤免疫及自身免疫性疾病中均具有重要的作用。目前對STING的研究主要集中在其活化下游激酶TANK結合激酶 1(TANK binding kinase 1,TBK1)和干擾素刺激因子 3(Interferon Regulatory Factor 3,IRF3)的分子機制及其在不同病原體誘導宿主產生固有免疫應答過程中的功能。而STING在進化上高度保守,人源性的STING和鼠源性的STING具有很高的同源性,因此小鼠常被作為STING功能研究中重要的動物模型,但兩者仍因種屬的特異性在某些方面仍存在差異。本課題組前期對人源性STING的啟動子進行了相關研究,目前尚無對小鼠STING基因啟動子方面的研究。因此,本課題主要針對小鼠STING基因啟動子的特征和調控機制進行研究。目的:尋找并克隆鑒定小鼠干擾素基因刺激因子(STING)的啟動子區(qū)及其啟動子核心功能區(qū)域,并進一步鑒定調控小鼠STING基因啟動子基本轉錄活性的關鍵轉錄因子,為揭示小鼠STING基因的表達調控機制及種屬特異性奠定基礎。方法:通過生物信息數據庫預測啟動子位置,以NIH3T3細胞抽提的基因組DNA為模板,利用PCR技術擴增獲取小鼠STING 5'上游的啟動子區(qū)序列(1005nt,-828～+177),將此核酸序列亞克隆至無啟動子活性的PGL3-Basic載體的多克隆位點,構建熒光素酶重組報告質粒。將構建的重組報告質粒瞬時轉染NIH3T3細胞及HEK293細胞,使用熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測其熒光素酶活性,鑒定其是否具有啟動子活性。利用步移缺失突變分析法對STING基因啟動子5'端進行缺失突變,分別亞克隆到pGL3-Basic載體上,瞬時轉染細胞后檢測各截短片段的熒光素酶活性,比較相對熒光素酶活性(RLU)后定位STING基因啟動子的核心功能區(qū)域。利用生物信息學軟件分析核心啟動子區(qū)并預測潛在的轉錄因子結合位點,進一步利用定點突變技術、si-RNA干擾及基因過表達技術、染色質免疫沉淀(chromatin immunoprecitation,ChIP)等實驗方法,分析轉錄因子對小鼠STING啟動子活性的影響及其作用機制。結果:經雙酶切、基因測序鑒定,成功克隆并構建了含有小鼠STING啟動子區(qū)序列的熒光素酶重組報告質粒pSTING-1005。熒光素酶活性實驗結果顯示,與載體pGL3-Basic比較,小鼠STING啟動子重組報告質粒在NIH3T3細胞及HEK 293細胞中均表現(xiàn)出明顯的啟動子活性。進一步分析STING基因5'端缺失的截短片段的熒光素酶活性后發(fā)現(xiàn),STING基因的核心啟動子區(qū)域位于-77～+177nt之間。利用生物信息學軟件對小鼠STING基因核心啟動子區(qū)域進行預測,該區(qū)域內包含了 GATA1、Sp1/Sp3、STAT和IK2等轉錄因子結合位點。將潛在的轉錄因子結合位點的關鍵性堿基進行定點突變,實驗結果表明轉錄因子GATA1和Sp1/Sp3結合位點對維持小鼠STING基因的基本轉錄活性具有重要作用。同時利用si-RNA干擾及基因過表達實驗進一步證實了 GATA1和Sp3可以調控STING基因啟動子活性,從而影響其翻譯和表達。ChIP實驗結果進一步證明了轉錄因子GATA1和Sp3可以與小鼠STING基因啟動子直接結合。結論:克隆并成功構建了小鼠STING基因啟動子的熒光素酶重組報告質粒,通過截短突變確定其核心啟動子區(qū)域位于轉錄起始位點-77至+177 nt內,轉錄因子GATA1和Sp3可正向調控小鼠STING基因啟動子的活性。ChIP實驗結果進一步證明了轉錄因子GATA1和Sp3對STING基因啟動子的作用是通過與STING的啟動子區(qū)特定的核酸序列直接結合而實現(xiàn)。
[Abstract]:Background: the innate immune response is the first line of the body against infection, plays a key role in antiviral immune process. Interferon gene stimulating factor (stimulator of interferon genes, STING) is an important signaling adaptor protein against DNA virus, also can be used as pattern recognition receptors (pattern, recognition receptor, PRR) direct recognition cAMP, cGMP participate in anti intracellular bacteria infection, STING also participate in immunity against RNA virus, and plays an important role in anti-tumor immunity and autoimmune diseases. The current research on STING mainly focus on the activation of downstream kinase TANK binding kinase 1 (TANK binding 1 kinase, TBK1) and interferon stimulating factor 3 (Interferon Regulatory 3 Factor, IRF3) and its molecular mechanism in different pathogens induce the process of innate immune response function. STING in the evolution of high Conservative, human STING and rat STING with high homology, so the mouse is often regarded as an important animal model for functional studies of STING, but they are still due to species specificity in some aspects still exist differences. The human STING promoter of ourprevious the related research, there is no study on promoter of mouse STING gene aspects. Therefore, this paper focuses on the mouse STING gene promoter characteristics and regulation mechanism were studied. Objective: to search and clone identification of mouse interferon stimulating factor gene (STING) promoter region and its promoter core functional areas, and further identification key transcriptional regulation of the mouse STING gene promoter transcriptional activity, lay the foundation for revealing the mechanism of expression regulation of mouse STING gene and species specificity. Methods: the biological information database to predict. Rotor position, using the genomic DNA of NIH3T3 cells was extracted as template, amplified the sequence of mouse STING promoter region upstream of the 5'by using the technology of PCR (1005nt, -828 ~ +177), the multiple cloning sites of the nucleic acid sequence was subcloned into plasmid PGL3-Basic promoter activity, luciferase reporter plasmid to construct recombinant constructs. The recombinant reporter plasmids were transiently transfected into NIH3T3 cells and HEK293 cells using luciferase reporter the luciferase activity, identification of its promoter activity. Using step mutation analysis of STING gene promoter 5' terminal deletion mutant shift deletion, were subcloned into pGL3-Basic vector and detect the truncated luciferase activity instantaneous after the transfection, relative luciferase activity (RLU) core functional areas after the localization of STING gene promoter by bioinformatics software analysis. The core promoter region and prediction of potential transcription factor binding sites, further using site directed mutagenesis technique, si-RNA interference and gene expression technology, chromatin immunoprecipitation (chromatin immunoprecitation, ChIP) and other experimental methods, analysis of transcription factor promoter activity of STING mice and its mechanism. Results: after double enzyme digestion, gene sequencing was successfully cloned and constructed with mouse STING promoter sequence of the recombinant luciferase reporter plasmid pSTING-1005. luciferase activity assay showed that, compared with the vector pGL3-Basic, the recombinant mouse STING promoter reporter plasmids in NIH3T3 cells and HEK 293 cells showed obvious promoter activity. Further analysis of the truncated fragments of STING gene 5'terminal the lack of luciferase activity after the discovery, the core promoter region of STING was located at -77 ~ +177nt. The use of biological Bioinformatics software to predict the mouse STING gene core promoter region, the region contains GATA1, Sp1/Sp3, STAT and IK2 transcription factor binding sites. The potential transcription factor binding sites are the key bases of site directed mutagenesis, the experimental results show that the transcription factor GATA1 and Sp1/Sp3 binding sites plays an important role in maintaining basic transcription the activity of mouse STING gene. At the same time by si-RNA interference and overexpression experiments further confirmed that GATA1 and Sp3 can regulate STING promoter activity, thus affecting the translation and expression of.ChIP experimental results further proved that the transcription factor GATA1 and Sp3 can be directly combined with mouse STING gene. Conclusion: cloned and constructed successfully luciferase reporter plasmid of recombinant mouse STING gene promoter, the truncated mutation determines its core promoter region in transcription initiation Site of -77 to +177 in NT, the activity of.ChIP experimental results of transcription factor GATA1 and Sp3 can positively regulate the mouse STING gene promoter further proved that the transcription factor GATA1 and Sp3 promoter of STING gene is achieved through direct binding with STING promoter region specific nucleic acid sequences.

【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R392

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本文編號：1566156