本文關鍵詞： 豬附紅細胞體 α-烯醇化酶基因 LAMP SYBR Green I 臨床應用　出處：《延邊大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：豬附紅細胞體病(Eperythrozoonosis)是由豬附紅細胞體(Mycoplasmasuis,M.suis)寄生于豬的紅細胞、血漿、組織液和骨髓中引起的一種多發(fā)性人獸共患傳染病。感染宿主范圍較廣,如豬、牛、山羊、狗、貓等,也包括人類。多呈隱性感染使機體免疫力下降,而導致與其它豬傳染病混合感染或繼發(fā)感染,嚴重阻礙了我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展,對養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生的危害較大。采取早期診斷是預防豬附紅細胞體病的關鍵,常規(guī)的診斷方法有涂片鏡檢、ELISA、PCR等,但由于這些診斷方法均需要特殊的儀器和設備,以及使用者應該具備一定的專業(yè)操作技能,而不能在基層養(yǎng)殖場進行推廣應用。環(huán)介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是Notomi等人建立的一種新型核酸擴增方法,可以精準識別出靶序列的4-6個特殊區(qū)域,通過BstDNA聚合酶在恒定的溫度條件下,快速擴增目的基因,經(jīng)電泳形成梯形條帶或SYBR Green Ⅰ染料染色后直接觀察結果。LAMP具有反應快、效率高、不需要特殊儀器和可直接觀測結果等優(yōu)點,使其成為廣大養(yǎng)殖場自行診斷動物傳染病的新型熱門方法。近幾年,M.suis才被鑒定劃歸為支原體屬(Mycoplasma),其基因組也剛被國外學者測通。α-烯醇化酶基因(α-enolase,eno)是新報道的具有粘附作用的豬附紅細胞體表面功能蛋白,常被用于分子生物學診斷方法的目的基因。因此,本試驗依據(jù)GenBank已發(fā)表的M.suis基因組(NC-015153.1)設計一對特異性引物,擴增M.suis的部分α-烯醇化酶基因,經(jīng)TA克隆和測序,根據(jù)測序正確的α-烯醇化酶基因,在基因保守區(qū)內(nèi)設計一套LAMP特異性引物,進行LAMP預試驗,對其反應溫度、時間、Mg2+濃度等條件進行優(yōu)化篩選,并進行敏感性、特異性、重復性試驗,將建立的LAMP方法用于Msuis的臨床檢測。結果表明,本試驗成功克隆到M.suis的部分α-烯醇化酶基因,長度為864bp。建立的LAMP方法的最適反應溫度為63℃,Mg2+最適濃度為6mmol/L,內(nèi)外引物最適濃度比為1:6,可在50 min內(nèi)完成檢測反應,并且通過SYBR Green Ⅰ染料染色后可直接觀察結果。特異性試驗顯示,對弓形蟲、豬鏈球菌Ⅰ型、大腸桿菌和牛源瑟氏泰勒蟲的基因組均無擴增,證明該方法具有良好的特異性;敏感性試驗顯示,可以檢測的最低稀釋倍數(shù)為10-6倍,即30copies/μL,比普通PCR方法的敏感度高100倍,證明該方法具有較高的敏感性;重復性試驗顯示,對5個不同批次模板以及對同一模板進行7次試驗,證明該方法具有良好的重復性。用建立的LAMP方法對吉林省龍井市某養(yǎng)豬場的84份血液樣本進行檢測,陽性率為41%,與普通PCR相比,檢出的陽性率高于普通PCR。結果顯示,本試驗建立的基于豬附紅細胞體α-烯醇化酶基因的LAMP方法特異性強、敏感性高、重復性好、操作簡便、不需要特殊儀器,可通顏色直接觀測結果,可用于基層養(yǎng)豬場M.suis的臨床診斷和推廣應用。
[Abstract]:Eperythrozoonosism (Eperythrozoonosism) is a multiple zoonotic infectious disease caused by M. suis, which is parasitized by Mycoplasmasuisus in pigs, plasma, tissue fluid and bone marrow. It has a wide range of infected hosts, such as pigs, cattle, goats, dogs, cats, etc. It also includes the fact that most of the occult infections of human beings reduce the immunity of the body, which results in mixed infection with other infectious diseases in pigs or secondary infections, which seriously hinders the healthy development of the pig industry in our country. Early diagnosis is the key to the prevention of Eperythrozoonosis in pigs. The routine diagnostic methods include smear microscopy and ELISA-PCR, but these diagnostic methods require special instruments and equipment. And users should have certain professional operation skills, but can not be popularized and applied in grass-roots farms. Loop-mediated isothermal amplification method Amplification (Lamp) is a new nucleic acid amplification method established by Notomi et al. 4-6 special regions of the target sequence can be accurately identified. The target gene can be rapidly amplified by BstDNA polymerase under constant temperature. The result of direct observation of the target gene by electrophoresis is trapezoidal band or SYBR Green 鈪，

本文編號：1552082