本文關(guān)鍵詞： 日本血吸蟲 綠色熒光蛋白 慢病毒載體　出處：《中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志》2017年03期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：目的了解日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)體內(nèi)能否表達(dá)外源綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP),并產(chǎn)生綠色熒光。方法構(gòu)建p EGFP-Lac Z-C1融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒,以聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)為轉(zhuǎn)染試劑,分別轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物293T細(xì)胞和感染小鼠后14 d的日本血吸蟲童蟲,未轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組不做任何處理;轉(zhuǎn)染后48 h,在熒光顯微鏡下觀察被轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞和日本血吸蟲童蟲是否有GFP綠色熒光產(chǎn)生;對(duì)被轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞和日本血吸蟲童蟲進(jìn)行β-半乳糖苷酶原位染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察是否有藍(lán)色產(chǎn)物產(chǎn)生。同時(shí),將日本血吸蟲童蟲放入培養(yǎng)293T細(xì)胞的12孔板中,分別在光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察。用未稀釋的、滴度為3×10~8菌落形成單位(CFU)/ml的慢病毒體外感染日本血吸蟲童蟲和293T細(xì)胞96 h后,在熒光顯微鏡下觀察是否有GFP綠色熒光產(chǎn)生。結(jié)果p EGFP-Lac Z-C1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,可以觀察到GFP綠色熒光,β-半乳糖苷酶原位染色后也可以觀察到藍(lán)色的斑點(diǎn),而在對(duì)照組和日本血吸蟲童蟲中,均未觀察到GFP熒光和藍(lán)色斑點(diǎn)。日本血吸蟲童蟲和293T細(xì)胞GFP熒光的比較發(fā)現(xiàn),293T細(xì)胞發(fā)出的GFP熒光亮度明顯高于日本血吸蟲童蟲的自發(fā)熒光,且293T細(xì)胞GFP熒光為艷綠色,而日本血吸蟲童蟲的自發(fā)熒光為黃綠色。在慢病毒感染實(shí)驗(yàn)中,未稀釋的慢病毒感染96 h后,在熒光顯微鏡下可以清晰地看到血吸蟲腸道外圍組織中有許多艷綠色的熒光亮點(diǎn),日本血吸蟲童蟲GFP的顏色及亮度與293T細(xì)胞中的基本一致,且熒光亮點(diǎn)的移動(dòng)與蟲體的肌肉運(yùn)動(dòng)基本保持一致。結(jié)論日本血吸蟲童蟲的背景熒光在外源GFP表達(dá)充足的情況下并不會(huì)影響熒光的觀察。未稀釋的慢病毒感染日本血吸蟲童蟲96 h后可提高轉(zhuǎn)染效率,增加GFP表達(dá)量,在體內(nèi)觀察到GFP的綠色熒光。
[Abstract]:Objective to investigate whether the exogenous green fluorescent protein can be expressed in Schistosoma japonicum and produce green fluorescence. Methods the expression plasmid of p EGFP-Lac Z-C1 fusion protein was constructed and polyethylenimine (PEI) was used as transfection reagent. The transfected mammalian 293T cells and Schistosoma japonicum infecting mice were treated without any treatment in the negative control group. 48 h after transfection, the GFP green fluorescence was observed in 293T cells and Schistosoma japonicum, and 尾 -galactosidase was used to stain the transfected 293T cells and Schistosoma japonicum in situ. At the same time, Schistosoma japonicum was placed in a 12-well plate cultured with 293T cells, observed under optical microscope and fluorescence microscope, respectively. Lentiviruses with a titer of 3 脳 10 ~ (8) colony forming unit (CFU / ml) were infected with Schistosoma japonicum and 293T cells in vitro for 96 h, and the GFP green fluorescence was observed under fluorescence microscope. Results after transfection of p EGFP-Lac Z-C1 into 293T cells, GFP green fluorescence was observed, and blue spots were observed after in situ staining of 尾 -galactosidase, while in the control group and schistosomiasis japonicum, GFP fluorescence and blue spots were not observed. The GFP fluorescence of Schistosoma japonicum and 293T cells was significantly higher than that of Schistosoma japonicum and 293T cells, and the GFP fluorescence of 293T cells was bright green. However, the autofluorescence of Schistosoma japonicum was yellowish green. In the experiment of lentivirus infection, after 96 h of undiluted lentivirus infection, there were many bright green fluorescent spots in the peripheral tissues of intestinal tract of Schistosoma japonicum under fluorescence microscope. The color and brightness of Schistosoma japonicum GFP are basically the same as those in 293T cells. Conclusion the background fluorescence of Schistosoma japonicum does not affect the observation of fluorescence when the expression of exogenous GFP is sufficient. The transfection efficiency of Schistosoma japonicum was improved after 96 h. The green fluorescence of GFP was observed in vivo by increasing the expression of GFP.
【作者單位】： 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)與微生物工程系;中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所世界衛(wèi)生組織熱帶病合作中心科技部國家級(jí)熱帶病國際聯(lián)合研究中心衛(wèi)生部寄生蟲病原與媒介生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(No.81271867)~~
【分類號(hào)】：R383.24

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