本文關(guān)鍵詞： 半枝蓮黃酮 HepG2細(xì)胞 CRISPR-Cas9 慢病毒載體　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：人體約80%～90%的腫瘤是由化學(xué)致癌物引起的�；瘜W(xué)致癌物在進(jìn)入體內(nèi)后,要受到體內(nèi)各種酶的代謝,Ⅱ相酶在防治腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。半枝蓮中黃酮類(lèi)化合物能很好的清除體內(nèi)的自由基,起到抗腫瘤的作用。課題組前期工作發(fā)現(xiàn)半枝蓮黃酮類(lèi)化合物能誘導(dǎo)Ⅱ相代謝酶的表達(dá),但半枝蓮黃酮類(lèi)化合物種類(lèi)眾多,對(duì)于各化合物的作用及其機(jī)理仍未明確。因此,我們開(kāi)展了對(duì)半枝蓮黃酮類(lèi)化合物活性成分及其機(jī)理的進(jìn)一步研究。第一部分ARE調(diào)控的綠色熒光蛋白報(bào)告基因細(xì)胞對(duì)半枝蓮不同極性部位的黃酮類(lèi)化合物篩選目的:通過(guò)ARE(anti-oxidative response element,抗氧化反應(yīng)元件)調(diào)控的綠色熒光蛋白報(bào)告基因細(xì)胞模型來(lái)篩選半枝蓮7個(gè)不同極性部位的黃酮類(lèi)化合物(A、B、C、D、E、F、G),初步探討半枝蓮黃酮類(lèi)化合物活性成分。方法:使用終濃度為50μg/mL的黃酮類(lèi)化合物(A、B、C、D、E、F、G)以及終濃度為100M的tBHQ(tertiary butylhydroquinone,叔丁基對(duì)苯二酚)分別對(duì)ARE調(diào)控的綠色熒光蛋白報(bào)告基因細(xì)胞HepG2-4ARE-TK-GFP處理24小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GFP(Green fluorescent protein,綠色熒光蛋白)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度。并檢測(cè)陽(yáng)性黃酮類(lèi)化合物G的劑量效應(yīng)。結(jié)果:黃酮類(lèi)化合物G顯示結(jié)果為陽(yáng)性,相對(duì)熒光強(qiáng)度為1.97倍,而黃酮類(lèi)化合物A、B、C、D、E、F均為陰性。黃酮類(lèi)化合物G濃度在80μg/mL時(shí)取得最大活性。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)對(duì)前期提取的7個(gè)不同半枝蓮黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行篩選,其中黃酮類(lèi)化合物G為其主要活性成分。第二部分 AhR基因敲除HepG2細(xì)胞模型的的初步構(gòu)建目的:通過(guò) CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated system,CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù))基因打靶技術(shù)敲除Hep G2(Human hepatocellular liver carcinoma cell line,人肝癌細(xì)胞系)內(nèi)的 AhR(aryl hydrocarbon receptor,芳香烴受體)基因,驗(yàn)證其可行性,為進(jìn)一步構(gòu)建AhR基因缺失的ARE調(diào)控的綠色熒光蛋白報(bào)告基因細(xì)胞Hep G2-4ARE-TK-GFP提供基礎(chǔ)方法:針對(duì)AhR基因設(shè)計(jì)了三個(gè)sgRNA(small guide RNA,引導(dǎo)RNA)位點(diǎn),合成其對(duì)應(yīng)的oligo雙鏈DNA后與線性的載體GV392連接后構(gòu)建AHR-sgRNA載體。對(duì)構(gòu)建的載體進(jìn)行慢病毒包裝后對(duì)培養(yǎng)的Hep G2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染陽(yáng)性結(jié)果抽提DNA后PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增,使用錯(cuò)配酶法檢測(cè)sgRNA活性結(jié)果:對(duì)AHR-sgRNA載體測(cè)序結(jié)果中找到了相應(yīng)的sgRNA序列,在隨后的感染后Hep G2細(xì)胞內(nèi)sgRNA活性的檢測(cè)中,三個(gè)sgRNA均表現(xiàn)出了活性,其中sgRAN3的活性最強(qiáng)。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR-Cas9基因打靶技術(shù)成功敲除了 HepG2細(xì)胞內(nèi)的AhR基因,成功構(gòu)建了 AhR基因缺失的Hep G2細(xì)胞,驗(yàn)證了使用CRISPR-Cas9基因打靶敲除Hep G2細(xì)胞內(nèi) AhR基因的可行性,對(duì)下一步構(gòu)建Nrf2/Keap1(nuclearfactorerythroid-2p45-related factor 2,核轉(zhuǎn)錄因子紅細(xì)胞系-2p45 相關(guān)因子/Kelch-like ECH-associated protein 1 Kelch,樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1)信號(hào)通路單相誘導(dǎo)Ⅱ相酶表達(dá)的細(xì)胞模型的構(gòu)建提供了基礎(chǔ)。
[Abstract]:The activity and mechanism of flavonoids from Scutellaria barbata ( A , B , C , D , E , F , G ) were studied by means of a green fluorescent protein reporter gene cell model regulated by ARE ( anti - oxidative response element ) . The expression of AhR gene in HepG 2 cell line ( human hepatocellular carcinoma cell line ) was determined by PCR ( Polymerase Chain Reaction ) .

【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7
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本文編號(hào)：1533373