本文關鍵詞： 家蠶核型多角體病毒 Bm90基因 λRed重組系統(tǒng) Bac-to-Bac系統(tǒng) 透射電子顯微鏡 熒光定量PCR　出處：《浙江理工大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是核型多角體病毒屬的典型代表,近年來,對BmNPV基因功能的探索從未停止,但仍有很多基因的功能未知。BmNPV orf90(Bm90)基因是BmNPV基因組中一個未知功能的保守基因,本文以Bm90基因為研究對象,深入研究該基因在整個病毒感染周期中對病毒復制、轉錄及組裝等方面的影響。利用λRed重組系統(tǒng)和Bac-to-Bac系統(tǒng)構建帶有多角體基因(polh)和增強型綠色熒光蛋白基因(egfp)的野生型病毒W(wǎng)tBacmid-polh-egfp、Bm90基因缺失型病毒Bm90ko-polh-egfp-Bacmid及Bm90基因回補型病毒Bm90re-polh-egfpBacmid。將3種重組病毒分別轉染家蠶卵巢細胞BmN,病毒滴度測定發(fā)現(xiàn)Bm90基因缺失型病毒的滴度值為零,即Bm90基因缺失使病毒失去了產生侵染性子代病毒粒子的能力。收集轉染重組病毒48 h后的BmN細胞進行透射電鏡觀察,進而分析Bm90基因缺失對子代病毒粒子組裝的影響,電鏡觀察結果發(fā)現(xiàn)在野生型和回補型病毒轉染的BmN細胞中存在大量的子代病毒粒子及病毒發(fā)生基質,而Bm90基因缺失型病毒轉染的BmN細胞中沒有子代病毒粒子及其他典型的桿狀病毒感染癥狀出現(xiàn),表明Bm90基因是子代病毒粒子組裝的必需基因。qPCR分析結果發(fā)現(xiàn)野生型與回補型病毒的復制水平在12 h到96 h不斷增加且兩者差異不顯著;而Bm90基因缺失型病毒的復制水平在12 h到48 h不斷增加,與野生型和回補型病毒復制水平相當,但48 h后Bm90基因缺失型病毒復制水平保持不變且顯著低于野生型和回補型病毒的復制水平(P0.05),表明Bm90基因不是病毒復制的必需基因,但顯著影響病毒的復制水平。qRT-PCR分析結果顯示Bm90基因的缺失使家蠶核型多角體病毒BmNPV早期基因lef-3、晚期基因vp39和極晚期基因p10的轉錄水平均具有顯著性的下調(P0.05),表明Bm90基因在病毒周期中對其他病毒基因的表達起調控作用。此外,構建原核表達體系PET-28a-Bm90表達純化Bm90蛋白并免疫新西蘭大白兔,獲得了Bm90蛋白的多克隆抗體,抗體效價達12800U。Western blot結果發(fā)現(xiàn)Bm90蛋白在轉染BmN細胞后72 h有表達,表明Bm90基因可能是病毒晚期表達基因。
[Abstract]:Bombyx mori NucleopolyhedrovirusBmNPV (Bombyx mori) is a typical representative of nuclear polyhedrosis virus. In recent years, the function of BmNPV gene has never stopped. But there are still many genes whose function is unknown. BmNPV orf90 (Bm90) gene is a conserved gene in the BmNPV genome. In this paper, the Bm90 gene is taken as the research object to study the replication of the gene in the whole virus infection cycle. Construction of wild-type virus with polyhedrosis gene (polh) and enhanced green fluorescent protein gene (GFP) by means of 位 Red recombination system and Bac-to-Bac system. WtBacmid-polh-egfpm90 gene deletion virus Bm90ko-polh-egfp-Bacmid and Bm90 gene complement type virus are constructed by means of 位 Red recombination system and Bac-to-Bac system. Bm90re-polh-egfpBacmid.Three recombinant viruses were transfected into Bombyx mori ovary cells BmN.The titer of Bm90 gene deletion virus was zero. That is to say, the Bm90 gene deletion caused the virus to lose the ability to produce the infective virus particles. The BmN cells transfected with recombinant virus for 48 h were observed by transmission electron microscope, and the effect of Bm90 gene deletion on the assembly of the offspring virus particles was analyzed. The results of electron microscopy showed that there were a large number of progeny virus particles and virogenic matrix in BmN cells transfected with wild type and compensatory virus. However, no offspring virus particles or other typical baculovirus infection symptoms appeared in BmN cells transfected with Bm90 gene deletion virus. The results showed that the replication level of wild type virus and complementary type virus increased from 12 h to 96 h, and there was no significant difference between them. The replication level of Bm90 gene deletion virus increased from 12 h to 48 h, which was similar to that of wild type virus and compensatory type virus. But after 48 hours, the replication level of Bm90 gene deletion virus remained unchanged and was significantly lower than that of wild type and compensatory virus, indicating that Bm90 gene was not an essential gene for virus replication. But the results of QRT-PCR analysis showed that the deletion of Bm90 gene resulted in significant down-regulation of transcription level of BmNPV early gene lef-3, late gene vp39 and extremely late gene p10 of Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus. Bm90 gene regulates the expression of other viral genes during the viral cycle. A prokaryotic expression system, PET-28a-Bm90, was constructed to express and purify Bm90 protein and immunize New Zealand white rabbits. The polyclonal antibody of Bm90 protein was obtained. The antibody titer reached 12800 U. Western blot. The results showed that Bm90 protein was expressed 72 hours after transfection of BmN cells. It is suggested that Bm90 gene may be a late expression gene of the virus.
【學位授予單位】：浙江理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;Q939.4

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本文編號：1528588