發(fā)布時間：2018-02-20 21:22

  本文關(guān)鍵詞： 降鈣素基因相關(guān)肽 前軟骨干細胞 細胞表面標記 細胞增殖 降鈣素基因相關(guān)肽 前軟骨干細胞 成骨分化 降鈣素基因相關(guān)肽 前軟骨干細胞 成骨分化 Wnt通路　出處：《華中科技大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分CGRP對前軟骨干細胞增殖的影響目的 體外獲取并培養(yǎng)純化SD大鼠前軟骨干細胞(PSCs),為以后的實驗提供細胞來源。觀察不同濃度梯度的降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)在體外對前軟骨干細胞增殖的影響,為后續(xù)試驗確定合適的CGRP刺激濃度。方法1.前軟骨干細胞的分離、純化和體外培養(yǎng)及鑒定：取出生24小時內(nèi)的SD大鼠乳鼠,手術(shù)顯微鏡下環(huán)行切取La Croix環(huán),體外培養(yǎng)細胞。磁性細胞分選系統(tǒng)分離純化得到前軟骨干細胞,并且傳代、擴增。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況和形態(tài)變化：2.采用細胞免疫化學方法檢測,辣根過氧化物酶標記,DAB顯色,檢測細胞表面FGFR-3表達情況；3.CCK-8法檢測干細胞的增殖：將純化后的第3代前軟骨干細胞置接種于96孔板中培養(yǎng),加入濃度分別為0、10-8、10-9、10-10mol/L的CGRP刺激,于孵育的第0、3、7、10、14d按CCK-8試劑盒的要求測定吸光度,繪生長曲線圖。比較不同濃度梯度的CGRP對前軟骨干細胞增殖的影響。結(jié)果1.免疫磁珠分離純化后的前軟骨干細胞絕大部分呈三角形或多角形,透明,貼壁生長,折光性良好,核大且胞漿少,細胞形態(tài)及大小較為均一。細胞免疫化學檢測可見純化后的PSCs胞漿中FGFR-3抗體染色陽性；2.對純化后的PCSCs計數(shù)進行細胞生長動力學分析后發(fā)現(xiàn),在相同的時間點,不同濃度的CGRP組間比較沒有顯著的統(tǒng)計學意義。結(jié)論1.免疫磁珠分選法可以簡便而有效獲得純化的性狀穩(wěn)定的前軟骨干細胞,,為以后的實驗提供了豐富的干細胞來源；2. 不同濃度的CGRP對體外培養(yǎng)的前軟骨干細胞的增殖沒有影響。第二部分CGRP對前軟骨干細胞成骨分化的影響目的 研究降鈣素基因相關(guān)肽在體外對前軟骨干細胞成骨標志性基因的RUNX2、 OPN、BGP及細胞外基質(zhì)Collagen Ⅰ的表達,以及堿性磷酸酶活性和礦化化結(jié)節(jié)產(chǎn)生的影響。方法1.分別以10-9mol/L和Omol/L的CGRP刺激在成骨培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)的實驗組和對照組的前軟骨干細胞；2.培養(yǎng)至第14d,茜素紅染色。在倒置顯微鏡鏡下觀察實驗組和對照組礦化結(jié)節(jié)形成的情況并拍照。用圖像分析軟件分析所得圖片;3.按堿性磷酸酶檢測試劑盒要求,分別在3、7、10、14d時檢測并比較對照組和實驗組的堿性磷酸酶的活性：4. 分別于成骨誘導培養(yǎng)的第7d、14d離心收集細胞,RT-PCR檢測并比較對照組和實驗組成骨細胞相關(guān)基因RUNX2、OPN、BGP及細胞外基質(zhì)Collage I基因的表達。結(jié)果1.經(jīng)CGRP刺激的前軟骨干細胞,在成骨誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d后茜素紅染色的結(jié)果與對照組相比,橘紅色礦化結(jié)節(jié)明顯增多,結(jié)節(jié)大。定量檢測結(jié)果顯示兩組間礦化結(jié)節(jié)的面積有顯著性差異；2. 兩組ALP含量測定,在培養(yǎng)第3d時,兩組間無顯著差異,7-14d時實驗組較對照組ALP含量呈極顯著增加的趨勢;3. RT-PCR檢測顯示7d和14d時成骨相關(guān)基因RUNX2、OPN、BGP及細胞外基質(zhì)Collagen I基因的表達均顯著增加。結(jié)論CGRP在體外可上調(diào)前軟骨干細胞成骨相關(guān)基因RUNX2、OPN、BGP及細胞外基質(zhì)Collagen I基因的表達,使礦化結(jié)節(jié)和堿性磷酸酶活性增加,誘導其向成骨分化。第三部分Wnt通路在CGRP誘導前軟骨干細胞成骨分化過程中的作用目的 探討經(jīng)典Wnt通路在CGRP誘導前軟骨干細胞成骨分化過程中的作用。方法1. 將第3代細胞接種至6孔培養(yǎng)板內(nèi)分為4組,分別為：Omol/L的CGRP+Omol/L的DKK-1:10-9mol/L的CGRP+0mol/L的DKK-1;0mol/L的CGRP+10-8mol/L的DKK-1;10-9mol/LCGRP+10-8mol/L的DKK-1。成骨誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)7d后,提取總蛋白。BCA法測定總蛋白濃度;2. Western blot檢測各組的蛋白β-catenin的表達,使用圖形軟件分析；3. RT-PCR檢測各組前軟骨干細胞成骨細胞相關(guān)基因Runx2、OPN、BGP及細胞外基質(zhì)Collagen Ⅰ基因的表達的變化。結(jié)果CRGP刺激前軟骨干細胞后明顯促進蛋白β-catenin表達。加入β-catenin抑制劑DKK-1后,β-catenin表達明顯降低,同時下調(diào)Runx2、OPN、BGP基因表達,但Collagen Ⅰ基因的表達沒有明顯改變。CGRP可使受DKK-1抑制的蛋白β-catenin表達顯著增加。結(jié)論CGRP可能部分通過激活經(jīng)典Wnt/β-catenin通路促進前軟骨干細胞向成骨細胞方向分化。
[Abstract]:Partithe effect of CGRP on precartilaginous stem cells proliferation in vitro to acquire and develop the purification of SD rat precartilaginous stem cells (PSCs) and provide a cell source for future experiments. Observation of different concentrations of calcitonin gene related peptide (CGRP) in vitro of precartilaginous stem cell proliferation, to determine the appropriate the concentration of CGRP for the following experiments. 1. separation methods of precartilaginous stem cells, purified and cultured in vitro and were identified: SD rats within 24 hours, under the surgical microscope circular cut La Croix ring, cells were cultured in vitro. The magnetic cell sorting system of purified PSCs, and passage amplification,. And the morphological changes of cells were observed by inverted phase contrast microscope: 2. using immunocytochemistry detection, horseradish peroxidase, DAB staining, detection of cell surface expression of FGFR-3; 3.CCK-8 method Detection of stem cell proliferation: purified after the third generation of the precartilaginous stem cells were seeded in 96 well plate culture, adding concentration of 0,10-8,10-9,10-10mol/L 0,3,7,10,14d in the CGRP stimulation, incubation was determined by CCK-8 kit, to draw a growth curve. To compare the effects of different concentrations of CGRP on precartilaginous stem cell proliferation. The results of precartilaginous stem cells after immunomagnetic separation and purification of 1. most triangular or polygonal, transparent, adherent growth, good refraction, big nucleus and little cytoplasm, cell morphology and size were uniform. Immunohistochemical detection of FGFR-3 showed the purified PSCs antibody positive staining in the cytoplasm; 2. of the purified PCSCs cell count growth dynamics analysis found that, at the same time, is not statistically significant different concentrations of CGRP group. Conclusion 1. immunomagnetic beads The sorting method can be simple and effective to obtain precartilaginous stem cells, purified the stability of traits for future experiments provide a rich source of stem cells; no effect of precartilaginous stem cells in 2. different concentrations of CGRP on the proliferation of cultured CGRP. The second part of precartilaginous stem differentiation objective to study the effect of calcitonin gene related peptide in vitro of precartilaginous stem cells of osteoblast marker genes RUNX2, OPN cells, the expression of BGP and Collagen of the extracellular matrix, and the effect of alkaline phosphatase activity and mineralization of nodules produced. Methods 1. respectively by 10-9mol /L and Omol/L CGRP in the stimulation of osteoblast culture medium induced the experimental group and the control group of precartilaginous stem cells; cultured to the 2. 14d, alizarin red staining. The experimental group was observed in the inverted microscope and the control group of mineralized nodule formation and photographed. Using image analysis software A analysis of the picture; 3. by the alkaline phosphatase assay kit, respectively at 3,7,10,14d was detected and compared with control group and experimental group of alkaline phosphatase activity: 7d 4. respectively in osteogenic medium, 14d cells were collected, RT-PCR was detected and compared with the control group and the experimental composition of osteoblast related genes RUNX2, OPN, the expression of BGP and extracellular matrix Collage I gene. Results 1. stimulated by CGRP Precartilage cells in osteogenic medium compared with the control group the cultivation results of alizarin red staining after 14d medium, orange red mineralized nodules increased significantly. Quantitative detection results showed nodules between two groups of mineralization area there was significant difference between the two groups of 2.; Determination of the content of ALP, 3D in culture, no significant differences between the two groups, 7-14d in experimental group than in the control group ALP was significantly increased; 3. RT-PCR showed 7d and 14d into Bone related genes RUNX2, OPN, BGP and the expression of extracellular matrix Collagen I gene increased significantly. Conclusion CGRP in vitro can upregulate precartilaginous stem cells into bone related genes RUNX2, OPN, BGP and the expression of extracellular matrix Collagen I gene, the mineralized nodules and alkaline phosphatase activity increased to induce a the third part of the Wnt pathway. The differentiation of precartilaginous stem cells osteoblast differentiation objective to investigate the role of canonical Wnt pathway in CGRP induced osteogenic differentiation of precartilaginous stem cells into the role in the induction of CGRP. 1. methods of the third generation of cells were inoculated in 6 well plates were divided into 4 groups, respectively: Omol/L CGRP+Omol/L DKK-1:10-9mol/L CGRP+0mol/L DKK-1; 0mol/L CGRP+10-8mol/L DKK-1; 10-9mol/LCGRP+10-8mol/L DKK-1. osteogenic induction culture medium 7d, determination of total protein concentration of total protein extracted by.BCA; 2. Western blot To detect the expression of -catenin protein beta groups, analysis of the use of graphics software; 3. RT-PCR detected precartilaginous stem related genes in Runx2 cells, OPN cells, BGP cells and extracellular matrix Collagen gene expression changes. Results CRGP stimulation of precartilaginous stem cells obviously increased the expression of -catenin protein beta beta -catenin inhibitor DKK-1 added. After the beta -catenin expression was significantly decreased, while the downregulation of Runx2, OPN, BGP gene expression, but the expression of Collagen gene was not significantly changed by.CGRP can make the protein beta -catenin inhibited DKK-1 expression increased significantly. Conclusion CGRP may promote precartilaginous stem cells to differentiate into osteoblasts by activating the classical Wnt/ beta -catenin pathway.

【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R683

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本文編號：1520056