本文關鍵詞： 日本三角渦蟲 Spsb基因 再生 表達分析　出處：《河南師范大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：SPSB蛋白家族由四個高度保守的成員(SPSB1-SPSB4)組成,共同特征是其氨基酸包含SPRY結構域和羧基(C)端的SOCS-box基序。雖然在高等動物和一些無脊椎動物中已克隆了Spsb基因并對其表達模式進行了分析,但是,到目前為止,這些基因確切的功能尚不清楚。本研究以日本三角渦蟲(Dugesia japonica)為實驗材料,克隆了DjSpsb基因的全長cDNA序列并對其表達模式進行了系統(tǒng)分析,結果如下:1、利用RACE技術首次在日本三角渦蟲中克隆了Spsb基因的全長c DNA序列。DjSpsb基因的cDNA全長為1251 bp,包含一個105 bp的5′端非翻譯區(qū)(5′UTR)和一個87 bp的3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)。其中3′端非翻譯區(qū)包含一個poly(A)尾和一個終止密碼子。最大開放閱讀框(ORF)為1059 bp,編碼一個由352個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。2、利用ExPASy,TMHMM 2.0、SMART、Inter Pro等其他在線軟件對該基因所推導的氨基酸序列進行生物信息學分析,結果表明:DjSPSB蛋白的分子量為40.90 k Da,理論等電點為9.04,含有一個保守的SPRY結構域和一個SOCS盒,為親水性核蛋白,存在多個磷酸化位點,無信號肽且不存在跨膜區(qū)。3、根據(jù)該基因所推導的氨基酸序列利用用貝葉斯MrBayes 3.1.2構建了系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)進化分析表明DjSpsb在多細胞動物進化過程中高度保守,且與Spsb1,Spsb2和Spsb4有較高的同源性。4、利用整體原位雜交、切片原位雜交和實時熒光定量PCR技術研究了DjSpsb基因在整體及再生渦蟲中的時空表達模式。結果表明:在性未成熟的整體渦蟲中,DjSpsb主要在頭部表達且邊緣部位陽性信號較強,此外,DjSpsb在神經(jīng)組織和腸支表達;在性成熟的個體中,陽性信號主要在頭部、睪丸和卵黃腺部位表達,卵巢部位不表達;在再生個體中,陽性信號在再生胚基表達。RT-PCR結果顯示,在尾再生頭部分,DjSpsb基因在切割后1,3和5天上調(diào)表達且在第5天達到峰值,切割后第7天其表達水平下降且與對照表達水平相似。5、應激反應實驗結果顯示:熱應激和乙醇培養(yǎng)誘導Djspsb基因高表達且在乙醇誘導下呈劑量效應,而高劑量的離子液體抑制其表達。研究結果提示:Djspsb基因可能在渦蟲再生過程特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)形成功能恢復過程中起著重要作用,另外,該基因可能是一個多功能基因,在渦蟲生殖系統(tǒng)的發(fā)育和應激保護過程中發(fā)揮作用。
[Abstract]:The SPSB protein family consists of four highly conserved members, SPSB1-SPSB4. The common feature is that its amino acids contain the SOCS-box motif at the end of SPRY domain and carboxyl motif. Although the Spsb gene has been cloned and analyzed in higher animals and some invertebrates, so far, The exact function of these genes is unclear. In this study, the full-length cDNA sequence of DjSpsb gene was cloned from Dugesia japonica, and its expression pattern was systematically analyzed. The results were as follows: 1: 1. The full-length cDNA sequence of Spsb gene and the cDNA length of Spsb gene were firstly cloned by using RACE technique. The cDNA length of the Spsb gene was 1251 BP, including a 105bp 5'untranslated region (5'UTRR) and an 87bp 3'terminal untranslated region (Utria). The 3'untranslated region contains a polymorphic A) tail and a termination codon. The maximum open reading frame (ORF) is 1059 BP, encoding a protein of 352 amino acid residues. ExPASy-TMHMM 2.0 SMARTInter Pro and other online software were used to detect the gene. The deduced amino acid sequence was analyzed by bioinformatics. The results showed that the molecular weight of the protein was 40.90 kDa, and the theoretical isoelectric point was 9.04. The protein contained a conserved SPRY domain and a SOCS box, which was a hydrophilic nucleoprotein with multiple phosphorylation sites. A phylogenetic tree was constructed by using Bayesian MrBayes 3.1.2 according to the deduced amino acid sequence of the gene. Phylogenetic analysis showed that DjSpsb was highly conserved in the evolution of multicellular animals. It has high homology with Spsb1, SPsb2 and Spsb4. In situ hybridization and real-time fluorescence quantitative PCR techniques were used to study the temporal and spatial expression patterns of DjSpsb gene in the whole and regenerated planaria. The results showed that the expression of DjSpsb gene was mainly in the head and the positive signal was strong at the edge of the whole parasite. In addition, DjSpsb was expressed in nerve tissues and intestinal branches; in sexually mature individuals, the positive signals were mainly expressed in the head, testis and yolk glands, but not in the ovary; in regenerated individuals, the positive signals were expressed in regenerated embryos. The expression of DjSpsb gene was up-regulated on the 3rd and 5th day after cleavage, and reached its peak on the 5th day. On the 7th day after cutting, the expression level of Djspsb decreased and was similar to that of the control. The results of stress reaction showed that heat stress and ethanol culture induced the high expression of Djspsb gene in a dose-dependent manner. The high dose of ionic liquid inhibits its expression. The results suggest that the Djspsb gene may play an important role in the regeneration process, especially in the recovery of central nervous system formation, and it may be a multifunctional gene. Play a role in the development of the reproductive system and stress protection.
【學位授予單位】：河南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78

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本文編號：1517184