發(fā)布時(shí)間：2018-02-12 01:16

  本文關(guān)鍵詞： A型副雞嗜血桿菌 血凝素蛋白 純化 間接ELISA　出處：《動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展》2017年12期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：原核表達(dá)A型副雞嗜血桿菌(Haemophilus paragallinarum serotype A,Hpgserotype A)的血凝素蛋白HA,并以HA蛋白為包被抗原,建立血清間接ELISA檢測(cè)方法�？寺pg HA基因,將其克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+)中進(jìn)行重組HA蛋白的誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化,并進(jìn)行Western blot鑒定;用純化后的HA蛋白作為包被抗原,優(yōu)化反應(yīng)條件,建立血清間接ELISA檢測(cè)方法,并進(jìn)行特異性、靈敏度和重復(fù)性試驗(yàn),最后對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。原核表達(dá)獲得大小約為37ku的重組HA蛋白;Western blot結(jié)果表明重組蛋白具有良好的特異性和抗原反應(yīng)性。Hpg間接ELISA優(yōu)化反應(yīng)條件為:抗原包被量每孔500ng,血清以1∶200倍稀釋作用1h,酶標(biāo)二抗以1∶2 500倍稀釋作用1h,TMB顯色時(shí)間為10min。在該優(yōu)化條件下,OD_(450)≥0.34為陽性,反之為陰性;特異性試驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)雞新城疫病毒、禽流感病毒、沙門菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌和大腸埃希菌陽性血清檢測(cè)均為陰性;對(duì)85份陽性血清進(jìn)行檢測(cè),敏感性為98.8%;重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明,批內(nèi)和批間OD_(450)值的變異系數(shù)分別1.5%~3.7%和6.5%~8%。用本試驗(yàn)建立的方法對(duì)臨床上215份雞血清樣品進(jìn)行檢測(cè),陽性率為25.1%。說明建立的ELISA檢測(cè)方法可用于Hpgserotype A抗體水平的檢測(cè)。
[Abstract]:The hemagglutinin protein of Haemophilus paragallinarum serotype A was expressed in prokaryotic expression of Haemophilus paragallinarum serotype Hpgserotype A, and the indirect ELISA detection method was established with HA protein as the coating antigen. The HA gene was cloned. It was cloned into the prokaryotic expression vector pET-28a () to induce the expression of the recombinant HA protein, then purified and identified by Western blot. The purified HA protein was used as the coated antigen to optimize the reaction conditions. To establish an indirect ELISA detection method for serum, and to carry out specificity, sensitivity and repeatability test. The recombinant HA protein of about 37 ku was obtained by Western blot. The results showed that the recombinant protein had good specificity and antigen-reactivity. The optimal reaction conditions of HPG indirect ELISA were as follows: antigen envelope quantity. At 500 ng / pore, the serum was diluted with 1: 200 times for 1 hour, and the enzyme labeled second antibody was diluted with 1: 2 500 times dilution for 1 h TMB for 10 min. Under the optimized conditions, the positive reaction time was more than 0.34. The results of specific tests showed that the positive sera of Newcastle disease virus, avian influenza virus, Salmonella, Staphylococcus aureus, Pasteurella multocida and Escherichia coli were all negative; 85 positive sera were tested. The sensitivity was 98.8. The results of repeatability test showed that the coefficients of variation of ODS450) were 1.5% and 6.5%, respectively. 215 chicken serum samples were detected by the method established in this experiment. The positive rate was 25.1%, which indicated that the established ELISA assay could be used to detect the level of Hpgserotype A antibody.
【作者單位】： 陜西省楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物工程分院;
【基金】：陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2016NY-096) 楊凌示范區(qū)重大科技項(xiàng)目(2016-XY-16)
【分類號(hào)】：S852.61

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