本文關(guān)鍵詞： 家蠶 球孢白僵菌 基因 抑菌作用 抗菌肽 蛋白質(zhì)組　出處：《江蘇科技大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是家蠶(Bombyx mori)的重要病原真菌,其所引起的白僵病是全球范圍內(nèi)較為常見的一類真菌病,常對蠶業(yè)生產(chǎn)造成重大危害。但是目前包括白僵病在內(nèi)的家蠶疾病都缺乏有效的治療手段,所以疾病的預(yù)防顯得至關(guān)重要。但是人們對家蠶響應(yīng)球孢白僵菌侵染的分子機(jī)制仍然知之甚少。本研究通過家蠶體表接種球孢白僵菌,檢測了家蠶感染球孢白僵菌后BmcecA、Bmgloverin2和BmLeb5三個(gè)免疫基因的表達(dá)模式,利用生物信息學(xué)工具和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)克隆三個(gè)免疫基因并分析其序列特征和生物學(xué)功能,實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證它們在球孢白僵菌感染免疫應(yīng)答過程中的功能和作用,并且在蛋白水平上檢測了家蠶感染球孢白僵菌后表達(dá)差異的蛋白。以家蠶p50為實(shí)驗(yàn)材料,利用RT-PCR技術(shù)克隆出BmCecA基因的開放閱讀框,該ORF編碼63個(gè)氨基酸,包含22個(gè)氨基酸的信號肽和37個(gè)氨基酸的成熟肽,通過蛋白結(jié)構(gòu)分析該成熟肽形成經(jīng)典的雙親α螺旋。實(shí)時(shí)熒光定量PCR表明,BmCecA在5齡家蠶的體壁、馬氏管、中腸、絲腺、血淋巴和脂肪體中均有表達(dá),在脂肪體中表達(dá)量最高,其次是血淋巴。在被球孢白僵菌誘導(dǎo)后,3齡蠶中該基因上調(diào)表達(dá)顯著,在36 hpi上調(diào)最高;在5齡家蠶中,BmCecA在脂肪體和血細(xì)胞中被顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。本研究構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-30a(+)-CecA,通過Western blot分析表明成功表達(dá)了BmCecA蛋白,該重組蛋白在體外對球孢白僵菌有明顯的抑菌活性。在證明了表達(dá)的BmCecA對球孢白僵菌抑菌作用的基礎(chǔ)上,為獲得足夠量的BmCecA蛋白進(jìn)行家蠶體內(nèi)抑菌試驗(yàn),通過固相合成法合成了BmCecA成熟肽,用質(zhì)譜和聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明其分子量約為4.07 kDa,高效液相色譜檢測其純度為93.7%。體內(nèi)和體外抑菌實(shí)驗(yàn)均表明家蠶BmCecA對球孢白僵菌有較高的抗菌活性。qRT-PCR結(jié)果表明,在3齡蠶感染球孢白僵菌的不同時(shí)間點(diǎn)Bmgloverin2均有上調(diào)表達(dá),尤其是在接種白僵菌42 h后,Bmgloverin2 mRNA的差異表達(dá)倍數(shù)最大;同時(shí)Bmgloverin2 mRNA在家蠶幼蟲的脂肪體中被誘導(dǎo)表達(dá)差異顯著,從12 hpi開始,感染組的Bmgloverin2 mRNA相對于對照組,一直是持續(xù)上調(diào)表達(dá)的。采用RT-PCR技術(shù)克隆出Bmgloverin2基因,將去掉信號肽的Bmgloverin2連接到pCzn1表達(dá)載體進(jìn)行重組表達(dá)。SDS-PAGE檢測了其表達(dá)的正確性,用純化的Bmgloverin2蛋白制備了多克隆抗體。用Western blot在誘導(dǎo)的家蠶脂肪體里能顯著檢測到Bmgloverin2蛋白。在BmCecA蛋白溶液中添加Bmgloverin2蛋白,在家蠶體外試驗(yàn)中能顯著的降低BmCecA的最小抑菌濃度,在體內(nèi)試驗(yàn)中能顯著的延長家蠶的致死中時(shí)間,證明了Bmgloverin2具有協(xié)同BmCecA抑菌的作用。通過RACE方法獲得了家蠶BmLeb5的cDNA的全長,該cDNA全長為808 bp,包含一個(gè)39 bp的5’-UTR、540 bp的開放閱讀框和一個(gè)229 bp 3’的UTR,該ORF編碼179個(gè)氨基酸,包含一個(gè)20個(gè)氨基酸的信號肽,含有4個(gè)RXXR基元。生物信息分析結(jié)果顯示其成熟肽的15位氨基酸殘基被O-糖基化。同源性比對顯示BmLeb5與家蠶BmLeb3同源性最高,進(jìn)化樹分析說明lebocins在家蠶中是一個(gè)多基因家族。首次成功體外表達(dá)和純化了BmLeb5的重組蛋白,并且用液質(zhì)聯(lián)用和肽指紋圖譜證實(shí)了表達(dá)的蛋白。對BmLeb5的mRNA的組織表達(dá)特異性和對感染球孢白僵菌的響應(yīng)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)在五齡三天的家蠶中,BmLeb5在脂肪體中表達(dá)水平最高,其次是體壁和絲腺,雖然在血淋巴、馬氏管、中腸中也能檢測得到,但是相對表達(dá)量很少;qRT-PCR結(jié)果也顯示,在家蠶被球孢白僵菌侵染后,BmLeb5在三齡整蠶、五齡脂肪體和血淋巴中均被顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá);說明BmLeb5可能在家蠶抵御球孢白僵菌的過程中起到重要作用。在被球孢白僵菌感染36 h后,取家蠶血淋巴和未感染幼蟲血淋巴做Label free非標(biāo)記蛋白定量分析,共鑒定到671個(gè)蛋白,篩選出87個(gè)差異蛋白,其中相對于未感染球孢白僵菌的對照組,感染組上調(diào)的蛋白質(zhì)有36個(gè),感染組下調(diào)的蛋白質(zhì)有40個(gè),只在感染組檢測到的蛋白質(zhì)有6個(gè),只在對照組中檢測到的蛋白質(zhì)有5個(gè),在顯著上調(diào)表達(dá)的36個(gè)蛋白質(zhì)中,包括絲氨酸蛋白酶、熱激蛋白70、溶菌酶、抗細(xì)菌肽、天蠶素B、貯存蛋白、攻擊素等可能與免疫反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)。通過KEGG數(shù)據(jù)庫比對注釋,這些差異蛋白質(zhì)在抵御球孢白僵菌侵染中主要參與了阿米巴病、MAPK信號通路、Hippo信號通路、Toll和Imd信號通路、溶菌體、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、病毒性的腫瘤發(fā)生、PI3K-Akt信號等信號傳導(dǎo)和代謝通路。本文取得的研究成果有利于從分子水平上深入理解家蠶乃至其它昆蟲抵御真菌侵染的防御機(jī)理,也為家蠶的抗菌育種提供理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江蘇科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S884.31

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本文編號：1503167