本文關(guān)鍵詞： VPS28 乳脂 功能驗(yàn)證 泛素化 ESCRTs 蛋白酶體　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：本課題組前期的GWAS及目標(biāo)捕獲測序研究發(fā)現(xiàn)VPS28基因與奶牛乳脂率和乳脂量顯著相關(guān),且其5’UTR區(qū)(具體位置用不用寫?)有一個(gè)C/T突變與乳脂率極強(qiáng)關(guān)聯(lián)(P=7.32E-60)。VPS28基因是內(nèi)體蛋白分選轉(zhuǎn)運(yùn)裝置ESCRTs的一個(gè)亞單位,與ESCRTs的功能和穩(wěn)定性有關(guān)。ESCRTs特異性識(shí)別泛素化膜蛋白并將其運(yùn)輸至溶酶體降解,此外它還參與蛋白酶體對(duì)胞質(zhì)中泛素化蛋白質(zhì)的降解。因此,本研究預(yù)測VPS28通過影響ESCRTs或蛋白酶體的功能而影響乳脂的生成,并在細(xì)胞水平上分別從DNA、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組三種水平上分析該基因突變位點(diǎn)的作用方式及其調(diào)控乳脂的機(jī)制,試圖探索VPS28對(duì)乳脂的作用通路。首先,本研究通過對(duì)VPS28基因進(jìn)行啟動(dòng)子活性分析發(fā)現(xiàn)其5'UTR的C/T突變可導(dǎo)致基因的表達(dá)量下降；然后對(duì)該突變進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合預(yù)測,發(fā)現(xiàn)其可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子由ADR1變?yōu)镹RF2,兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域分別是二鋅指結(jié)構(gòu)和亮氨酸拉鏈,且前者與DNA結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)及結(jié)合強(qiáng)度均大于后者。因此,本研究認(rèn)為該突變通過改變轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合方式使VPS28基因表達(dá)下調(diào)。然后,本研究利用RNA干擾技術(shù)將BMEC中的VPS28進(jìn)行干擾,并在轉(zhuǎn)錄水平分析其對(duì)乳脂的調(diào)控機(jī)制。通過對(duì)比分析相關(guān)基因的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)VPS28對(duì)乳脂的影響可能主要通過影響ESCRTs及蛋白酶體的功能影響了脂肪酸的吸收和從頭合成。為進(jìn)一步驗(yàn)證,本研究又在BMEC中檢測了相關(guān)蛋白等相關(guān)的生化指標(biāo)的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)將VPS28干擾后,泛素化的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CD36、脂肪分化相關(guān)蛋白ADFP及甘油三酯的表達(dá)水平表達(dá)水平均上升(P0.05),蛋白酶體的活性顯著下降(P0.05),并在電子顯微鏡下觀察到干擾VPS28的細(xì)胞中存在數(shù)量更多體積更大的脂肪滴。該結(jié)果表明VPS28受抑制可通過阻礙ESCRTs對(duì)泛素化膜蛋白的降解及蛋白酶體對(duì)胞質(zhì)中泛素化蛋白質(zhì)的降解,以增加脂肪酸吸收和從頭合成,最終提高甘油三酯合成增加乳脂生成。最后,本研究又將干擾前后的BMEC進(jìn)行iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析,以全面揭示VPS28對(duì)乳脂合成與分泌的調(diào)控機(jī)制和作用通路。通過對(duì)篩選到的203個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)VPS28受到抑制后主要對(duì)脂類生成和轉(zhuǎn)運(yùn)造成影響,然后將這些差異表達(dá)蛋白進(jìn)行通路圖的構(gòu)建,得到了以VPS28為中心且較為清晰的通路圖。結(jié)合第二部分結(jié)果,本研究發(fā)現(xiàn)VPS28被抑制后主要通過兩種方式調(diào)控乳脂生成：1：VPS28低表達(dá)阻礙ESCRT功能,蓄積泛素化膜蛋白CD36提高BMEC脂肪酸吸收；2；VPS28低表達(dá)降低蛋白酶體活性,蓄積胞質(zhì)中泛素化蛋白蓄積脂肪酸合成酶FASN及乙酰輔酶A羧化酶ACACA增加脂肪酸的從頭合成,最終增加乳脂合成。
[Abstract]:The results of GWAS and target capture sequencing showed that the VPS28 gene was significantly correlated with milk fat rate and milk fat content in dairy cows. ) there is a C / T mutation strongly associated with milk fat rate. VPS28 gene is a subunit of ESCRTs, which is related to the function and stability of ESCRTs. EscRTs specifically recognizes the ubiquitin membrane protein and transports it to lysosomal degradation. It is also involved in the degradation of ubiquitin proteins in the cytoplasm by proteasome. Therefore, this study predicted that VPS28 affects the production of milk fat by affecting the function of ESCRTs or proteasome. At the cellular level, we analyzed the action mode of the mutation site and the mechanism of regulating milk fat from the three levels of DNA, transcriptional and proteome, respectively, in order to explore the mechanism of VPS28 acting on milk fat. First of all, we tried to explore the mechanism of the effect of VPS28 on milk fat. In this study, we analyzed the promoter activity of VPS28 gene and found that the C / T mutation of 5 UTR could lead to the decrease of gene expression, and then the transcription factor binding prediction of the mutation was carried out. It was found that the transcription factor changed from ADR1 to NRF2. The DNA binding domain of the two transcription factors was dizinc finger structure and leucine zipper respectively, and the site number and binding strength of the former to DNA were higher than that of the latter. This study suggests that the mutation can down-regulate the expression of VPS28 gene by changing the binding of transcription factors to DNA. Then, RNA interference technique is used to interfere the VPS28 in BMEC. The regulation mechanism of milk fat was analyzed at the transcriptional level. It was found that the effect of VPS28 on milk fat may affect the absorption and ab initio synthesis of fatty acids by affecting the functions of ESCRTs and proteasome. In order to further verify, the expression level of related biochemical indexes, such as related proteins, was detected in BMEC. After finding that the VPS28 is interfered with, The expression levels of ubiquitin fatty acid transporter CD36, adipose differentiation related protein ADFP and triglyceride increased, while the activity of proteasome decreased significantly, and the presence of interfering VPS28 cells was observed under electron microscope. The results show that the inhibition of VPS28 can be achieved by blocking the degradation of ubiquitin membrane protein by ESCRTs and the degradation of ubiquitin protein in cytoplasm by proteasome. In order to increase fatty acid absorption and ab initio synthesis, triglyceride synthesis and milk fat production were increased. Finally, the BMEC before and after interference was analyzed by iTRAQ proteomics. In order to reveal the regulation mechanism and pathway of VPS28 on milk fat synthesis and secretion, the enrichment analysis of 203 differentially expressed proteins showed that the inhibition of VPS28 mainly affected the formation and transport of lipids. Then we construct the pathway map of these differentially expressed proteins and obtain a clear path map centered on VPS28. In this study, it was found that the low expression of VPS28 inhibited by VPS28 was inhibited by two ways, and the accumulation of Ubiquitin membrane protein CD36 increased the low expression of VPS28 in BMEC fatty acids and decreased the activity of proteasome. Ubiquitin fatty acid synthase (FASN) and acetyl-coenzyme A carboxylase (ACACA) in the accumulative cytoplasm increased the ab initio synthesis of fatty acids and ultimately increased the synthesis of milk fat.
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S823

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