發(fā)布時間：2018-02-08 12:12

  本文關(guān)鍵詞： 耐藥菌 耐藥基因 接合轉(zhuǎn)移 腸道 斑馬魚 水環(huán)境　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景:環(huán)境中抗生素耐藥性細菌(簡稱耐藥菌)的污染及抗生素耐藥基因的擴散已成為全球危機。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道,耐藥菌正蔓延至世界各地,到2050年,抗生素耐藥每年將導致100萬人早死。抗生素耐藥基因的擴散情況日趨嚴峻,以至于其已被列為一項新型環(huán)境污染物,成為當今國際研究的重點和熱點�？股啬退幓虻乃睫D(zhuǎn)移是導致耐藥基因擴散的重要原因。耐藥基因大多編碼在質(zhì)粒上,通過質(zhì)粒介導的接合轉(zhuǎn)移將耐藥基因在微生物間進行傳播和擴散是基因轉(zhuǎn)移最常見,也是最有效的方式。地表水是耐藥菌和耐藥基因的巨大儲存庫。它不僅匯聚和容納了來自降水徑流,醫(yī)院污水、生活污水、養(yǎng)殖污水和實驗室污水等各種來源的的耐藥菌、耐藥基因甚至多重耐藥基因外,還承載著一部分內(nèi)源性的污染,比如耐藥基因在水環(huán)境中的隨機耐藥突變和自然轉(zhuǎn)移。水生動物是生存在水環(huán)境中的重要生物,其攝食的環(huán)境中充滿了耐藥菌和耐藥基因。水生動物腸道是細菌生長和繁殖的重要場所,同時,腸道中定植的大量固有菌群都可以作為潛在的受體菌。因此,耐藥基因在水生動物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和擴散也可能是地表水耐藥基因內(nèi)源性污染的一部分。但是,耐藥基因是否能在水生動物體內(nèi)發(fā)生擴增,目前尚未見報道�；虬l(fā)生抗性突變和自然轉(zhuǎn)移的效率只有百萬分之一。并且研究發(fā)現(xiàn),即使在水中存在的各種物理、化學和生物因素尤其是豐富的DNA酶類的作用下,也無法使耐藥基因變性和分解。水中耐藥菌和耐藥基因的污染依然嚴重。除此之外,還有研究報道了在水產(chǎn)養(yǎng)殖的水體及魚的糞便和腸道中檢出耐藥菌和耐藥質(zhì)粒�；谝陨先渴聦�,我們認為水環(huán)境中的耐藥基因除了接納各種水體中的耐藥基因和在水環(huán)境中發(fā)生耐藥突變和隨機轉(zhuǎn)移的少量耐藥基因外,更主要的是其在水生動物體內(nèi)轉(zhuǎn)移與擴增的結(jié)果。綜上所述,課題提出“水生動物腸道是地表水中耐藥基因轉(zhuǎn)移和擴增的重要場所”假說。研究目的和意義:本研究旨在通過建立耐藥基因在水生動物體內(nèi)定植和轉(zhuǎn)移的模型,在采用細菌培養(yǎng)和分子生物學等技術(shù)方法的基礎上,定性、定量地研究耐藥菌及耐藥基因在水體動物體內(nèi)定植和轉(zhuǎn)移的規(guī)律,闡明耐藥基因在水生動物腸道內(nèi)的轉(zhuǎn)移和擴增機制,摸清耐藥基因發(fā)生定植和轉(zhuǎn)移的消化道部位與轉(zhuǎn)移發(fā)生機理,以及明確腸道內(nèi)接受耐藥基因的接合子的種類和數(shù)量。課題研究成果為進一步豐富人們對耐藥基因在動物體內(nèi)轉(zhuǎn)移和擴增的規(guī)律和機制的認知及提供了充分的理論依據(jù),同時也為水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥,水源水保護以及生態(tài)環(huán)境的污染和管理提供了數(shù)據(jù)依據(jù)和技術(shù)支撐。研究內(nèi)容和研究方法:(1)采用RED重組技術(shù)構(gòu)建供體菌K12Cm: RP4,并通過將供體菌飼喂給斑馬魚構(gòu)建RP4質(zhì)粒介導的耐藥基因在斑馬魚腸道內(nèi)接合轉(zhuǎn)移模型。(2)采用選擇性平板篩選和qPCR技術(shù)研究斑馬魚糞便中耐藥菌和耐藥基因的體外排出量隨時間的變化規(guī)律。(3)利用選擇性平板篩選和qPCR技術(shù)研究耐藥菌和耐藥基因在斑馬魚腸道內(nèi)的時空分布規(guī)律。(4)采用雙熒光標記供體菌,流式細胞分選并聯(lián)合16S rDNA高通量測序的方法腸道鑒定腸道和糞便中受體菌的細菌物種和豐度組成。(5)利用qPCR法檢測RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移調(diào)控基因在斑馬魚腸道中的mRNA表達。研究結(jié)果:(1)斑馬魚腸道和糞便的固有菌群都不含有RP4質(zhì)粒,除了對氨芐青霉素耐藥外,對四環(huán)素,卡那霉素和氯霉素均敏感。因此課題利用RED重組技術(shù),在野生株大腸桿菌K12的基礎上構(gòu)建了基因組被氯霉素抗性基因cat標記,并攜帶RP4質(zhì)粒的供體菌K12Cm: RP4。通過每日定時定量向飼料中摻入供體菌,持續(xù)喂食斑馬魚,建立耐藥質(zhì)粒在斑馬魚腸道內(nèi)的接合轉(zhuǎn)移模型。(2)斑馬魚攝入的外源性耐藥菌,大部分排出體外并沉積在糞便。12%的糞便固有細菌通過RP4質(zhì)粒的接合作用獲得了耐藥基因。喂食斑馬魚供體菌90天后停止,糞便中耐藥菌和耐藥基因排出的規(guī)律曲線可以分為三個階段:上升期,平臺期和下降期。在攝入108cfu/(d·fish)供體菌的高劑量組,cat基因和traG基因在平臺期的糞便排出相對數(shù)量分別為2.37%和15%,而攝入107cfu/(d·fish)供體菌的中劑量組,cat基因和traG基因在平臺期的糞便排出相對數(shù)量都不到1%。與高劑量組相比,中劑量組的供體菌和接合子達到平臺期所用的時間更短,產(chǎn)生的接合子數(shù)少大約一個數(shù)量級。在攝入106cfu/(d·fish)供體菌的低劑量組中沒有觀察到明顯的供體菌和耐藥基因的排出規(guī)律,也沒有檢測到接合子。接合子的產(chǎn)生數(shù)量和到達平臺期的時間與供體菌的喂食濃度相關(guān)。(3)外源性耐藥菌和耐藥基因在整個消化道內(nèi)的分布是極不均勻的。前腸和中腸中耐藥菌和耐藥基因存在的數(shù)量較少,并且它們的分布沒有顯著性差異。后腸是外源性耐藥菌和接合子定植,以及耐藥基因分布的最主要的消化道場所,其中接合子的數(shù)量是其它腸段中的將近25倍。在喂食供體菌的過程中,耐藥菌可以在腸道內(nèi)定植,同時耐藥基因在腸道內(nèi)發(fā)生了大量的轉(zhuǎn)移和擴散。但是外源性供體菌K12Cm:RP4在腸道內(nèi)的定植具有暫時性,一旦斑馬魚不再攝入供體菌,腸道內(nèi)的耐藥菌和接合子數(shù)量會迅速下降,這可能是與腸道內(nèi)缺乏抗生素選擇壓力有關(guān)。(4)腸道和糞便的接合子中既包括可培養(yǎng)細菌,也包括非可培養(yǎng)細菌,后者占全部接合子的90.4%～97.2%。其中氣單胞菌屬(Aeromonas)豐度最高,占全部細菌的90%以上(均值為90.0%～96.7%),是腸道固有菌群中接合轉(zhuǎn)移發(fā)生頻率最高,最容易獲得RK2質(zhì)粒的物種。其它的接合子主要來自Proteobacteria,Firmicutes和Fusobacteria菌門(加起來占大約5%)。除Aerowonas外,來自Proteobacteria門的可培養(yǎng)細菌Shewanella以及Enterobacteriaceae也是腸道固有菌群中重要的接合子。(5)耐藥質(zhì)粒在斑馬魚腸道內(nèi)轉(zhuǎn)移和大量擴增與調(diào)控基因在后腸的mRNA表達有關(guān)。在平臺期,后腸中trbBp基因的mRNA表達量上調(diào)到7.16× 10-3 copies/cell,是上升期mRNA表達量的24倍。TrbBp基因的明顯上調(diào)促使了細胞間的交配配對,從而形成接合的通道,促進了接合轉(zhuǎn)移的第一步過程。同時,平臺期trfAp基因的mRNA表達也在后腸出現(xiàn)了明顯的上調(diào),均值達到2.42×10-2 copies/cell,促使了RP4質(zhì)粒攜帶耐藥基因的跨膜轉(zhuǎn)運,以及質(zhì)粒DNA的復制、轉(zhuǎn)移和分配,從而促進了接合轉(zhuǎn)移的第二個過程。然而在前腸和中腸,平臺期trbBp和trfAp基因的mRNA表達則上調(diào)的不夠顯著。因此,后腸是耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率最高并且最活躍的消化道腸段。研究結(jié)論:1、建立了穩(wěn)定的RP4質(zhì)粒介導的耐藥基因在斑馬魚腸道內(nèi)轉(zhuǎn)移和擴散的水生動物模型。2、斑馬魚攝入的外源性耐藥菌,大部分會排出體外并沉積在糞便。12%的糞便固有細菌通過接合轉(zhuǎn)移攜帶了 RP4質(zhì)粒。喂食斑馬魚供體菌一段時間后停止,糞便中耐藥菌和耐藥基因排出的規(guī)律曲線可以分為上升,平臺和下降三段。3、后腸是耐藥菌和接合子定植,以及耐藥基因分布的最主要的消化道場所。4、斑馬魚腸道受體菌中非可培養(yǎng)細菌占90.4%～97.2%,其中最重要的接合子是Aeromonas,占90%以上�？膳囵B(yǎng)細菌只占不到10%,主要包括Enterobacteriaceae和Shewanella。5、耐藥質(zhì)粒在斑馬魚腸道內(nèi)轉(zhuǎn)移和大量擴增與調(diào)控基因在后腸的mRNA表達有關(guān)。后腸是耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率最高,最活躍的腸段。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R378

【參考文獻】

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