本文關(guān)鍵詞： 布魯氏菌 B.melitensis M5-90-△wbkC菌株 miRNAs qRT-PCR 靶基因預(yù)測　出處：《海南大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：布魯氏菌(Brucela.melitensis)是革蘭氏陰性菌,該病引起人和動物感染,在全世界較廣泛流傳,對人身安全構(gòu)成威脅,給世界經(jīng)濟帶來負擔。wbkC作用于O-側(cè)鏈的生物合成途徑中催化GDP-4-NH2-4,6雙脫氧甘露糖轉(zhuǎn)換成GDP-4-甲酰胺基-4,6雙脫氧甘露糖,是布魯氏菌脂多糖O抗原合成的重要步驟。構(gòu)建羊布魯氏菌B.melitensis M5-90-△wbkC株,為研究與wbkC基因相關(guān)的microRNAs(miRNAs)奠定基礎(chǔ),為深入研究布魯氏菌分子致病機制和設(shè)計更安全、更有效疫苗提供依據(jù)。本實驗根據(jù)NCBI上B.melitensis M5-90基因組序列信息,查找wbkC基因序列及其上游(N)、下游(C)序列信息,查找pEGFP-N1質(zhì)粒Kanar序列信息。分別設(shè)計wbkC基因N端C端同源臂和Kanar片段上下游引物。以B.melitensisM5-90基因組為模板,聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction PCR)擴增wbkC基因左右同源臂序列。以pEGFP-N1質(zhì)粒為模板PCR擴增Kanar序列。凝膠回收片段,分別連接至pMD20-T載體上。XbwI、KpnI酶切下N端同源臂,Kpnl、BamHI酶切下Kanar片段,BamHI、BstXI酶切下C端同源臂,回收片段。將pGEM-7ZF質(zhì)粒也用相同的酶切,使產(chǎn)生相同的粘性末端,依次將N端同源臂、Kanar片段和C端同源臂連接pGEM-7ZF質(zhì)粒,構(gòu)建pGEM-7ZF-AwbkC自殺質(zhì)粒,測序鑒定,將測序鑒定正確的pGEM-7ZF-△wbkC自殺質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至B.melitensis M5-90感受態(tài)細胞中,用含氨芐和卡那霉素雙抗性選擇培養(yǎng)基篩選陽性菌,菌落PCR鑒定,挑選的陽性菌培養(yǎng)使之同源重組,獲得穩(wěn)定遺傳。成功構(gòu)建B.melitensisM5-90-△wbkC 菌株。B.melitensis M5-90和B.melitens s M5-90-△wbkC 菌液,分別感染 RAW264.7 細胞,4 h后提取總RNA,分別進行miRNAs基因芯片分析,對B.melitensisM5-90和B.melitensis M5-90-AwbkC 在 RAW264.7 細胞差異表達 miRNAs,用 TaqMan 探針法實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)對鑒定差異表達的miRNAs,驗證結(jié)果:有10 miRNAs表達上下調(diào)結(jié)果和miRNAs基因芯片的熱圖結(jié)果相符合,其中,mmu-miR-574-3p、mmu-miR-669c-3p、mmu-miR-669p-3p、mmu-miR-466h-5p 表達下調(diào),mmu-miR-1949、mmu-miR-155-5p、mmu-miR-6240、mmu-miR-3473a、mmu-miR-7012-5p、mmu-miR-7024-5p表達上調(diào)。利用在線網(wǎng)站對△△Ct2的5個miRNAs靶基因進行預(yù)測。
[Abstract]:Brucela.melitensis (Brucella melitensis) is a gram-negative bacterium that causes human and animal infections and is widely spread around the world and poses a threat to personal safety. The effect of wbkC on the biosynthesis of O- side chain catalyzes the conversion of GDP-4-NH _ 2-4N _ 6 dideoxymannose to GDP-4-formamide _ 4. 6 dideoxymannose is an important step in the synthesis of lipopolysaccharide O antigen of Brucella vulgaris. B.melitensis M5-90- wbkC strain was constructed. It lays a foundation for the study of microRNAsmiRNAsassociated with wbkC gene, and makes it safer to study the molecular pathogenic mechanism and design of Brucella. Based on the genome sequence information of B.melitensis M5-90 on NCBI, the wbkC gene sequence and its upstream sequence were searched. Downstream C) sequence information. To find out the Kanar sequence information of pEGFP-N1 plasmid. To design the homologous arm of N-terminal C terminal of wbkC gene and the upstream and downstream primers of Kanar fragment, respectively. 0 genome was used as template. Polymerase Chain Reaction PCR. The left and right arm sequences of wbkC gene were amplified. PEGFP-N1 plasmid was used as template PCR to amplify Kanar sequence. It was ligated to pMD20-T vector. XbwI- KpnI enzyme was used to cut down the Kanar fragment of KpnlBamHI. The pGEM-7ZF plasmid was digested with the same enzyme to produce the same sticky end, and then the N-terminal homologous arm was sequenced. Kanar fragment and C-terminal homologous arm were ligated with pGEM-7ZF plasmid to construct pGEM-7ZF-AwbkC suicide plasmid and sequenced. The correct suicide plasmid pGEM-7ZF- wbkC was transformed into B. melitensis M5-90 cells. Positive bacteria were screened by double resistant culture medium containing ampicillin and kanamycin, colony PCR was identified, and the selected positive bacteria were cultured for homologous recombination. Successful construction of B.melitensis M5-90- wbkC strains. B.melitensis M5-90 and B.melitens s. M5-90-wbkC liquid. The total RNAs were extracted from RAW264.7 cells for 4 h and were analyzed by miRNAs microarray. B. melitensis M5-90 and B.melitensis M5-90-AwbkC expressed miRNAs differently in RAW264.7 cells. PCR(Quantitative Real-time PCR was used to identify the differentially expressed miRNAs by TaqMan probe method. The results showed that 10 miRNAs down-regulated results were consistent with those of miRNAs microarray, including mmu-miR-574-3p. The expression of mmu-miR-669c-3pmmu-miR-669p-3pmmu-miR-466h-5p was down-regulated by mmu-miR-1949. Mmu-miR-155-5pmmu-miR-6240 mmu-miR-3473a mmu-miR-7012-5p. The expression of mmu-miR-7024-5p was up-regulated. Five miRNAs target genes of Ct2 were predicted by online website.
【學位授予單位】：海南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.61

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本文編號：1490842