本文關(guān)鍵詞： Am Rosea1基因 轉(zhuǎn)錄組分析 脅迫耐受性 程序化細(xì)胞死亡 OsZOU　出處：《山東師范大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：MYB基因家族是植物中數(shù)量最多的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,R2R3-MYB基因是MYB基因家族中最大的一個(gè)亞家族。R2R3-MYB基因不僅參與植物的發(fā)育及代謝過程,同時(shí)還在生物脅迫以及非生物脅迫耐性中發(fā)揮重要作用。Am ROSEA1屬于R2R3-MYB蛋白,是調(diào)節(jié)金魚草花色素分布及密度的關(guān)鍵因子。Am Rosea1之前被引入煙草、番茄、矮牽牛以及棉花等多個(gè)雙子葉物種中,并且顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株花青素或其他次級代謝物的含量。為了研究Am Rosea1異位表達(dá)對于水稻生長發(fā)育的影響,我們將Am Rosea1轉(zhuǎn)入日本晴水稻,檢測了轉(zhuǎn)基因水稻中花青素以及類黃酮的含量,并進(jìn)行了高鹽脅迫以及干旱脅迫實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn),外源Am Rosea1基因能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻對于高鹽脅迫以及干旱脅迫的耐性。我們對野生型水稻以及轉(zhuǎn)基因水稻在正常生長環(huán)境以及高鹽或干旱脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測序分析,發(fā)現(xiàn)一系列和脅迫相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄水平受到了外源Am Rosea1的影響。這些受影響的基因涉及脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、激素信號通路、離子平衡以及活性氧的清除。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1、獲得過量表達(dá)Am Rosea1的轉(zhuǎn)基因水稻植株我們構(gòu)建了35S啟動(dòng)子啟動(dòng)Am Rosea1過量表達(dá)的表達(dá)載體,并將其轉(zhuǎn)入水稻栽培品種日本晴中。利用Am Rosea1特定的引物,對抗性苗進(jìn)行PCR驗(yàn)證,共有24棵PCR陽性植株。半定量實(shí)驗(yàn)證明OXR20,OXR21和OXR22三個(gè)植株中Am Rosea1的表達(dá)量較高。2、測量花青素和總類黃酮的含量為檢測Am Rosea1的過量表達(dá)對水稻花青素和總類黃酮積累量的影響,我們用分光光度法測量了成熟種子、三葉期以及抽穗期葉子中的含量,發(fā)現(xiàn)Am Rosea1的過量表達(dá)并沒有影響轉(zhuǎn)基因水稻植株中花青素和總類黃酮的含量。3、檢測轉(zhuǎn)基因植株對于高鹽和干旱脅迫的耐性經(jīng)干旱脅迫處理之后,OXR20、OXR21和OXR22的存活率分別為78%±5.6%,85%±8.2%和80%±7.1%,均高于WT植株20.8%±1.7%的存活率;高鹽脅迫處理之后,OXR20、OXR21和OXR22的存活率分別為70%±5.9%、75%±5.6%和69%±4.3%,WT植株全部死亡。這些結(jié)果表明:過量表達(dá)Am ROSEA1基因顯著提高了轉(zhuǎn)基因水稻植株對于干旱和高鹽脅迫的耐性。4、轉(zhuǎn)錄組分析為了研究轉(zhuǎn)基因株系脅迫耐性的分子機(jī)制,我們將OXR21作為轉(zhuǎn)基因株系的代表。取OXR21和WT在脅迫處理前以及脅迫處理不同時(shí)間點(diǎn)的葉片,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。篩選與脅迫響應(yīng)相關(guān)的,在OXR21和WT之間差異表達(dá)的基因,結(jié)果如下:與WT相比,在PEG處理的0 h、6 h和24 h,OXR21中分別有64、282和50個(gè)干旱脅迫響應(yīng)基因表達(dá)上調(diào),49、240和33個(gè)干旱脅迫響應(yīng)基因表達(dá)下調(diào);在鹽處理的0 h、1 h和6 h,OXR21中分別有49、197和58個(gè)鹽脅迫響應(yīng)基因表達(dá)上調(diào),34、266和26個(gè)鹽脅迫響應(yīng)基因表達(dá)下調(diào)。對差異表達(dá)基因的venn分析表明:分別有8個(gè)和12個(gè)基因在PEG處理的0 h、6 h、24 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)和鹽處理的0 h、1 h、6 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)都上調(diào);分別有20個(gè)基因在PEG處理的6 h、24 h和鹽處理的1 h、6 h的表達(dá)上調(diào);分別有15和26個(gè)基因在PEG處理的24 h和鹽處理的6 h的表達(dá)上調(diào)。對差異表達(dá)基因的GO富集分析表明,在“生物學(xué)過程”這一類別里,干旱脅迫和鹽脅迫的差異基因分別富集到6個(gè)GO term里,其中有4個(gè)是相同,它們是“對內(nèi)源性刺激響應(yīng)”“對非生物刺激響應(yīng)”“對脅迫響應(yīng)”和“對刺激響應(yīng)”。KEGG分析表明,無論是在干旱脅迫條件下還是在鹽脅迫條件下,與WT植株相比,轉(zhuǎn)基因植株中的茉莉酸信號通路均被促進(jìn),而乙烯信號通路均被抑制。差異表達(dá)的基因里包含有鉀離子高親和運(yùn)輸?shù)鞍�、果糖基轉(zhuǎn)移酶等與滲透保護(hù)相關(guān)的蛋白的編碼基因,以及過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶(APX)等與氧化脅迫相關(guān)的蛋白的編碼基因。另外,RD22、熱激蛋白、LEA蛋白和RAB16A,這些脅迫響應(yīng)蛋白;轉(zhuǎn)錄因子DREB1F、MYB48和NAC134;信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,絲氨酸-蘇氨酸激酶、CIPK14、CIPK15的編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平,在WT和轉(zhuǎn)基因植株之間也表現(xiàn)出差異。另外,還有一些不知功能的基因的表達(dá)被改變�？傊�,Am ROSEA1在水稻中過量表達(dá)通過直接或間接地改變一系列基因的表達(dá)水平,使得轉(zhuǎn)基因水稻植株獲得了較WT高的鹽脅迫耐性和干旱脅迫耐性。被子植物的胚乳由受精極核發(fā)育而來,為胚胎的發(fā)育提供一些信號。胚乳在種子發(fā)育的早期,為胚胎提供營養(yǎng);在有永久胚乳的種子中,胚乳還為萌發(fā)時(shí)的幼苗提供營養(yǎng)。谷類種子的胚乳不僅是地球上人類和牲畜最重要的糧食資源,同時(shí)能為加工商品和生物燃料提供原材料。因此,研究胚乳的發(fā)育不僅具有重要的理論意義,還能產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益。大多數(shù)被子植物的胚乳發(fā)育類型為核型,發(fā)育過程經(jīng)歷:合胞體期,細(xì)胞化,內(nèi)層淀粉胚乳和外層糊粉層胚乳的分化以及細(xì)胞的程序化死亡。目前,對于胚乳早期發(fā)育的研究已經(jīng)有了很大進(jìn)展,但對于胚乳細(xì)胞死亡過程的研究仍十分有限。At ZOU基因編碼的b HLH轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)節(jié)擬南芥胚乳程序化細(xì)胞死亡的重要因子。作為重要糧食作物和單子葉模式植物的水稻,其種子中保留有永久性的淀粉胚乳。為研究水稻中ZOU同源基因在水稻胚乳發(fā)育以及胚胎發(fā)育中的功能,更好地認(rèn)識(shí)水稻胚乳降解的調(diào)控機(jī)制,我們克隆了水稻中ZOU的同源基因,進(jìn)行了基因表達(dá)分析,功能互補(bǔ)試驗(yàn),構(gòu)建了GUS報(bào)告載體、正義表達(dá)載體、反義表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化水稻。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:1、水稻ZOU基因的進(jìn)化與表達(dá)分析通過序列比對和進(jìn)化分析,我們發(fā)現(xiàn)水稻中存在兩個(gè)ZOU同源基因:LOC_Os04g35010(Os ZOU-1)和LOC_Os02g34320(Os ZOU-2)。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測它們在營養(yǎng)生長期水稻的根、莖、葉、拔節(jié)孕穗期的小花、花后2天、5天、7天以及9天的種子中的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)Os ZOU-1在營養(yǎng)器官以及受精前的種子中表達(dá)量極低,在DAP2的種子中輕微表達(dá),DAP5時(shí)表達(dá)量很高,之后降低。Os ZOU-2主要在莖和葉中表達(dá),在種子中表達(dá)量極低。2、Os ZOU-1基因互補(bǔ)擬南芥zou-4突變體表型轉(zhuǎn)化At ZOUpromoter::Os ZOU-1的擬南芥zou-4突變體的表型得到部分回復(fù);轉(zhuǎn)化At ZOUpromoter::Os ZOU-2未能改變zou-4突變體的表型。3、通過GUS染色檢測Os ZOU-1在種子中的表達(dá)模式用報(bào)告載體Os ZOU-1promoter::GUS轉(zhuǎn)化水稻,我們發(fā)現(xiàn),在受精后3天的種子上沒有GUS信號;受精后5天的種子整個(gè)胚乳區(qū)都有GUS信號;之后GUS信號的范圍逐漸縮小至種子的背部區(qū)域。4、Os ZOU-1組成性表達(dá)水稻植株的表型用組成性過量表達(dá)的載體Ubipromoter::Os ZOU-1轉(zhuǎn)化水稻,轉(zhuǎn)化株系表現(xiàn)出與At ZOU組成性過表的擬南芥株系(zou-1D)相似的表型:植株矮小,葉片窄且沿葉邊緣向上卷曲,育性降低。另外我們還發(fā)現(xiàn):組成性過表株系的穎殼細(xì)胞變小導(dǎo)致穎殼變窄進(jìn)而導(dǎo)致種子窄;淀粉胚乳積累不充分,不能完全充滿整個(gè)果皮。5、Os ZOU-1表達(dá)沉默的水稻植株的表型用反義載體ZOUpromoter::Os ZOU-1anti-sense轉(zhuǎn)化水稻植株,轉(zhuǎn)基因種子未能正常進(jìn)行PCD,胚胎同胚乳粘連在一起;沉默株系種子的生長停滯在大約受精后第8天;淀粉積累明顯較WT少。上述結(jié)果證明:Os ZOU-1在水稻胚乳發(fā)育中起到了調(diào)控水稻胚乳程序性細(xì)胞死亡的作用。Os ZOU-1過量表達(dá)以及Os ZOU-1表達(dá)沉默的種子中,淀粉積累均不足,我們推測胚乳程序性細(xì)胞死亡影響淀粉的積累。本研究的創(chuàng)新點(diǎn):本研究首次將Am Rosea1基因?qū)氲剿?Oryza sativa L.)中。異位表達(dá)的Am ROSEA1通過直接或間接地調(diào)節(jié)不同基因的表達(dá),提高了轉(zhuǎn)基因水稻對高鹽和干旱脅迫的耐受,這為利用該基因提高其他水稻品種的非生物脅迫耐受提供了一條可能的途徑。本研究首次報(bào)道了Os ZOU基因在調(diào)控水稻胚乳程序性細(xì)胞死亡中的功能,以及PCD異常的水稻種子中淀粉胚乳的積累情況,有助于我們更好地認(rèn)識(shí)水稻種子發(fā)育過程中,胚乳細(xì)胞程序性死亡的調(diào)節(jié)機(jī)制以及營養(yǎng)物質(zhì)代謝同結(jié)構(gòu)發(fā)育之間的關(guān)系。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2;S511

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本文編號：1490197