本文關(guān)鍵詞： 基因輸送 電荷反轉(zhuǎn)型陽(yáng)離子聚合物 酯酶響應(yīng) HeLa腹腔瘤模型 TRAIL　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：腫瘤內(nèi)成纖維細(xì)胞是腫瘤重要的支撐組成部分,對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及其耐藥和轉(zhuǎn)移重扮演著極為重要的角色。目前研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)成纖維細(xì)胞受到如化療藥物引起的損傷時(shí),會(huì)分泌大量WNT16B等信號(hào)分子,促使腫瘤細(xì)胞的耐藥、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。傳統(tǒng)化療藥物選擇性差,在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí),會(huì)不可避免地?fù)p傷腫瘤成纖維細(xì)胞,導(dǎo)致其療效差。運(yùn)用基因治療的手段從源頭上改變腫瘤細(xì)胞自身蛋白表達(dá),使其分泌大量的治療蛋白,或是沉默致病基因表達(dá),不僅作用持續(xù)時(shí)間久,還可以通過載體的設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)特異性殺死腫瘤細(xì)胞而不刺激腫瘤反彈通路,從而克服化療藥物非選擇性殺傷引起的毒性和腫瘤反彈。但是,如何實(shí)現(xiàn)基因治療選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞而不傷害成纖維細(xì)胞是至今未解決的難題。陽(yáng)離子聚合物作為非病毒載體被廣泛地應(yīng)用于基因輸送,其與DNA形成的納米復(fù)合物必須在細(xì)胞核或細(xì)胞內(nèi)有效解離,才能使DNA高效表達(dá)。一般情況下,陽(yáng)離子聚合物與帶負(fù)電荷DNA之間的強(qiáng)靜電相互作用使得納米復(fù)合物難以解開釋放DNA。因此,通過控制納米復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的解離即可起到調(diào)控其基因表達(dá)的目的。我們發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞內(nèi)酯酶的活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成纖維細(xì)胞,由此我們?cè)O(shè)想：在酯酶催化下能夠從正電變?yōu)殡娭行曰蜇?fù)電荷的陽(yáng)離子聚合物,其與DNA形成的納米復(fù)合物將能夠在腫瘤細(xì)胞內(nèi)由于聚合物失去正電荷而有效地與DNA解離、使DNA能夠表達(dá)治療蛋白而殺死腫瘤細(xì)胞；而在成纖維細(xì)胞中,由于低的酯酶活性使該聚合物仍保持正電性而不能釋放DNA、DNA不能有效表達(dá)從而不能產(chǎn)生治療蛋白,進(jìn)而不會(huì)損傷成纖維細(xì)胞,從而實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞選擇性的基因治療。本論文第一部分設(shè)計(jì)并合成了一種可以響應(yīng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)酯酶而實(shí)現(xiàn)電荷翻轉(zhuǎn)的陽(yáng)離子聚合物(Esterase responsive gene delivery polymer,簡(jiǎn)寫為ERP)[N-丙酸(4-乙酰氧基)芐基酯]-N-甲基季胺化聚乙烯亞胺(N-[3-(p-acetyloxybenzyloxyoxo)propyl)]-N-methyl-quaternized PEI)。ERP在陽(yáng)離子態(tài)時(shí)能夠有效包裹壓縮DNA,形成粒徑在80 nm左右、電勢(shì)為10 mV的穩(wěn)定的納米顆粒。進(jìn)入細(xì)胞后,在細(xì)胞內(nèi)酯酶的作用下,ERP的乙酰酚基酯會(huì)快速水解,觸發(fā)釋放酚基芐醇的反應(yīng),直接生成羧酸根而與氨基形成中性的聚離子對(duì),實(shí)現(xiàn)了陽(yáng)離子聚合物的電勢(shì)由正向負(fù)的轉(zhuǎn)變,使聚合物失去與DNA的電荷相互作用而使復(fù)合物快速解離并釋放出DNA。同時(shí),電中性的聚合物大大降低了對(duì)轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的干擾,從而提高了基因表達(dá)效率。與不能進(jìn)行電荷反轉(zhuǎn)的碘甲烷季胺化的聚乙烯亞胺QPEI-M和不帶酚基酯鍵的對(duì)照載體QPEI-BP相比,其轉(zhuǎn)染效率提高了100至1000倍；并且由于DNA的快速釋放,使得轉(zhuǎn)染2小時(shí)后ERP/pLUCI表達(dá)熒光素酶即達(dá)到106RLU/毫克蛋白,為陽(yáng)性對(duì)照PEI/pLUCI的100倍。同時(shí),由于腫瘤細(xì)胞HeLa中酯酶的含量顯著高于成纖維細(xì)胞NIH3T3, ERP/pLUCI在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)效率是NIH3T3細(xì)胞中的1000倍,實(shí)現(xiàn)了在腫瘤細(xì)胞中的選擇性轉(zhuǎn)染及表達(dá)目的蛋白。本論文第二部分是基于上述酯酶響應(yīng)的電荷反轉(zhuǎn)型聚合物設(shè)計(jì)了弱正電性脂質(zhì)層DC-Chol/DOPE包裹的ERP/DNA'‘核殼”式納米復(fù)合物(lipid-coated esterase-responsive charge-reversal polyplexes, LERPs)應(yīng)用于體內(nèi)HeLa腹腔瘤模型的轉(zhuǎn)染和抑瘤。在體內(nèi)富含酯酶的環(huán)境中,DC-Chol/DOPE脂質(zhì)層有效地保護(hù)ERP/DNA復(fù)合物使其在到達(dá)腫瘤細(xì)胞前保持足夠的穩(wěn)定性；在進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后,LERPs/DNA可迅速地蛻去脂質(zhì)體外殼、暴露出ERP/DNA,響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)酯酶的水解快速釋放DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)LERPs/pLUCI在100%血清中仍有高達(dá)107數(shù)量級(jí)的蛋白轉(zhuǎn)染效率,且具有基因高陽(yáng)性表達(dá)率,并仍保持在腫瘤細(xì)胞上的優(yōu)先表達(dá)(相對(duì)于對(duì)成纖維細(xì)胞NIH3T3)。在體內(nèi)HeLa腹腔瘤荷瘤鼠模型上,LERPs/pLUCI實(shí)現(xiàn)了100%的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率,轉(zhuǎn)染后腫瘤組織中熒光素酶表達(dá)值比Lipo2000高出近百倍,比PEI25K體系高出近千倍。在此基礎(chǔ)上,我們利用LERPs輸送腫瘤自殺基因TRAIL(LERPs/pTRAIL),比較了基因輸送體系LERPs/pTRAIL與陽(yáng)性對(duì)照體系PEI25K/pTRAIL的基因治療和三種宮頸癌臨床化療藥物伊立替康(CPT11)、紫杉醇(PTX)和順鉑(CDDP)的療效,發(fā)現(xiàn)LERPs/pTRAIL的基因治療比化療藥物有著更好的抑瘤效果并能有效地抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移與反彈,大大地延長(zhǎng)了荷瘤鼠的生存期。機(jī)理研究表明,LERPs/pTRAIL能夠更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞,而對(duì)腫瘤組織成纖維細(xì)胞幾乎沒有影響,使成纖維細(xì)胞不會(huì)大量分泌促腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的因子WNT16B。生物安全性實(shí)驗(yàn)表明LERPs/pTRAIL與化療藥物相比具有更好的生物安全性。在HeLa皮下瘤模型和的膀胱癌腹腔瘤模型上進(jìn)一步驗(yàn)證了LERPs/pTRAIL很好的抑瘤效果和選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞影響很小的特性。本論文第三部分進(jìn)一步設(shè)計(jì)了具有清晰化學(xué)結(jié)構(gòu)的酯酶響應(yīng)型陽(yáng)離子聚合物體系：4-乙酰氧基芐氯季銨化的聚[2-(N.N-二烷基氨基)乙基聚丙烯酸酯]。通過將烷基改變?yōu)榧谆�、乙基或丁�?制備了三種疏水性逐漸增加的季胺化聚合物(PQDMA、PQDEA、PQDBA)。在HeLa細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)側(cè)鏈為乙基時(shí)的PQDEA/DNA納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染效果最好,其次為PQDBA、PQDMA的納米復(fù)合物。PDEA分子量為14KDa時(shí)的季胺鹽PQDEA轉(zhuǎn)染效果最高,可達(dá)到108RLU/毫克蛋白的轉(zhuǎn)染效率,且納米復(fù)合物入胞的速度、入胞的量和破溶酶體的速度都要優(yōu)于PEI25K/pLUCI。將LERPs/pDNA體系的脂質(zhì)層引入到PQDEA/DNA納米復(fù)合物上,制備了脂質(zhì)化納米復(fù)合物體系LPQDEAs/pDNA,應(yīng)用于輸送治療基因TRAIL。在細(xì)胞水平驗(yàn)證了其轉(zhuǎn)染效率和誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的能力,在體內(nèi)HeLa腹腔瘤模型上進(jìn)行了抑瘤實(shí)驗(yàn)和療效評(píng)估,證明LPQDEAs/pTRAIL與化療藥物治療相比可以顯著延長(zhǎng)荷瘤動(dòng)物的生存期。最后在LPQDEAs/DNA的表面引入PEG化脂質(zhì)DSPE-PEG和TPGS,制備了長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)化納米復(fù)合物,細(xì)胞水平上證實(shí)了長(zhǎng)循環(huán)遮蔽層的引入沒有顯著降低轉(zhuǎn)染效率,可用于尾靜脈注射的皮下瘤模型的治療。
[Abstract]:A cationic polymer which can be used for gene therapy to kill tumor cells without stimulating tumor cells can be effectively dissociated from the source , thereby preventing the tumor cells from being able to express the tumor cells . In the presence of esterase in vivo , the expression efficiency of ERP / pLUCI in HeLa cells was increased by 100 to 1000 times . PQDBA ) . The transfection efficiency of pDEA / pDNA was higher than that of PEI25K / pLUCI .

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.5;R450
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本文編號(hào)：1489998