本文關(guān)鍵詞： 水稻 MGD 轉(zhuǎn)基因煙草 低磷脅迫 脂質(zhì)重塑　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：高等植物中,單半乳糖甘油二酯(MGDG)和雙半乳糖甘油二酯(DGDG)是組成葉綠體中光合膜的主要膜脂類型,其中MGDG是DGDG合成的前體,因而MGDG的合成在植物的正常生長發(fā)育中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。單半乳糖甘油二酯合成酶(MGD)是合成MGDG的關(guān)鍵酶。目前對(duì)MGD的研究多集中在雙子葉植物尤其是模式植物擬南芥,而對(duì)單子葉植物中MGD的類型和功能研究相對(duì)較少。為了研究單子葉植物中MGD的類型以及功能,本研究以單子葉模式植物粳稻品種日本晴為研究材料,通過RACE法分離并克隆出三個(gè)OsMGD基因,通過生物信息學(xué)軟件對(duì)OsMGD同源基因的類型、亞細(xì)胞定位以及功能進(jìn)行初步預(yù)測(cè)分析,并構(gòu)建過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草來研究水稻MGD同源基因在植株生長以及低磷脅迫下的功能和作用機(jī)制。主要獲得以下結(jié)果:(1)通過NCBI數(shù)據(jù)庫中在線工具Blast,利用擬南芥以及秈稻中的MGD基因序列,在粳稻品種日本晴中,共Blast到三個(gè)MGD基因的部分序列,通過RACE法分離并克隆這三個(gè)OsMGD基因,分別為OsMGD/02g、OsMGD/08g、OsMGD/09g。通過對(duì)多種植物中MGD氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)OsMGD/02g與擬南芥MGD2和MGD3在同一進(jìn)化分枝,則OsMGD/02g初步預(yù)測(cè)為Type B型MGD;OsMGD/09g則與擬南芥MGD1在同一進(jìn)化分枝,初步預(yù)測(cè)為Type A型MGD;而OsMGD/08g隸屬另一進(jìn)化分枝,與上述兩種Type類型的進(jìn)化距離較遠(yuǎn),且此進(jìn)化分枝中均為單子葉植物MGD,因此初步推測(cè)OsMGD/08g隸屬于單子葉植物特有的新類型MGD。另外通過生物信息學(xué)軟件分別對(duì)三個(gè)OsMGD的跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位以及啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)這三個(gè)OsMGD蛋白都是親水性蛋白,且均不含有跨膜區(qū)域,OsMGD/02g和OsMGD/09g定位于葉綠體,而OsMGD/08g定位于線粒體。分析這三個(gè)OsMGD基因啟動(dòng)子順式作用元件發(fā)現(xiàn)這三個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)均存在與逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件。(2)利用半定量RT-PCR分別檢測(cè)三個(gè)OsMGD基因在不同水稻組織中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)OsMGD/02g和Os MGD/09g均在葉和莖中表達(dá)量較高,在根和花中表達(dá)量較低;而OsMGD/08g則是在葉、根、莖、花中的表達(dá)量都很低。隨后對(duì)這三個(gè)基因在低磷脅迫、干旱脅迫以及鹽脅迫下葉和根中的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)無論在低磷脅迫、干旱脅迫還是鹽脅迫時(shí),葉中OsMGD/02g表達(dá)量都是先升高后降低,根中OsMGD/02g的表達(dá)量則是持續(xù)升高;而OsMGD/08g只有在低磷脅迫時(shí)會(huì)強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá);在水稻葉中,OsMGD/09g在不同的脅迫下表達(dá)量變化不同,而在水稻根中,OsMGD/09g的表達(dá)并不受這三種脅迫影響。通過對(duì)三個(gè)OsMGD在不同組織以及不同逆境脅迫下的表達(dá)模式分析,初步證實(shí)系統(tǒng)進(jìn)化樹對(duì)這三個(gè)OsMGD的Type分類。(3)利用Gateway法構(gòu)建三個(gè)OsMGD基因的植物表達(dá)載體,并通過葉盤法完成煙草轉(zhuǎn)化工作。通過潮霉素的篩選,轉(zhuǎn)基因煙草幼苗基因組DNA的PCR檢測(cè),以及定量qRT-PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá),各篩選3個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系,結(jié)合野生型煙草進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行表型分析。在正常條件下與野生型煙草相比,不同OsMGD基因超表達(dá)均提高了煙草中的葉綠素含量和類胡蘿卜素含量,增強(qiáng)了凈光合速率,進(jìn)而增加了轉(zhuǎn)基因煙草的生長速率,提高了煙草的葉鮮重,從而使得轉(zhuǎn)OsMGD煙草的長勢(shì)較好。(4)為了研究OsMGD同源基因在低磷脅迫下的功能和作用機(jī)制,通過盆栽實(shí)驗(yàn),對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型煙草進(jìn)行低磷脅迫處理。與野生型煙草相比,低磷處理后三個(gè)OsMGD基因超表達(dá)煙草老葉上的壞死斑明顯較少且沒有野生型煙草壞死斑嚴(yán)重,而且轉(zhuǎn)基因煙草在低磷脅迫下的葉綠素含量、凈光合速率均顯著高于野生型煙草,葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、ΦPSII以及ETR在轉(zhuǎn)基因煙草中的下降幅度相較與野生型SR1較小,說明OsMGD同源基因超表達(dá)后緩解了低磷脅迫對(duì)煙草植株的傷害,轉(zhuǎn)基因煙草的耐低磷能力提高。(5)利用氣相色譜對(duì)低磷脅迫下煙草老葉中脂質(zhì)組分進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)低磷處理后,與野生型煙草相比,轉(zhuǎn)基因煙草中MGDG含量均顯著高于野生型SR1,且轉(zhuǎn)基因煙草中DGDG的上升幅度更大,說明低磷脅迫下,OsMGD同源基因超表達(dá)煙草中增強(qiáng)了MGDG和DGDG的合成。本研究中低磷處理后野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草中的磷脂含量均顯著降低,但在低磷脅迫下,相對(duì)于野生型SR1,轉(zhuǎn)基因煙草中磷脂的下降幅度更小。另外,計(jì)算GL/PL以及DGDG/MGDG的比值后發(fā)現(xiàn),超表達(dá)OsMGD同源基因煙草在低磷脅迫下具有較高的GL/PL和DGDG/MGDG,表明有更多的可以形成雙層膜的DGDG轉(zhuǎn)移到質(zhì)體外膜來替代缺失的磷脂,從而維持膜的完整性和穩(wěn)定性。因此,通過調(diào)控半乳糖脂的合成能力加強(qiáng)了低磷脅迫下的脂質(zhì)重塑,然后維持膜結(jié)構(gòu)的完整以及穩(wěn)定,進(jìn)而維持葉綠體以及其他亞細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和功能,緩解低磷脅迫對(duì)植物造成的傷害,從而提高植物對(duì)低磷脅迫的抗性。(6)通過比較OsMGD/02g、OsMGD/08g以及OsMGD/09g基因超表達(dá)煙草在低磷脅迫下的生理指標(biāo)以及脂質(zhì)組分變化,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)OsMGD/08g基因煙草對(duì)低磷脅迫的耐受性更強(qiáng),其次是轉(zhuǎn)OsMGD/02g基因煙草。OsMGD/08g可能是在長時(shí)間低磷脅迫時(shí)發(fā)揮作用,且很可能是低磷脅迫誘導(dǎo)OsMGD/08g基因表達(dá)后直接在線粒體膜上利用磷脂降解代謝物二�；视王�(DAG)作為底物催化合成MGDG,并通過線粒體上可能存在的雙半乳糖甘油二酯合成酶(DGD)合成DGDG,直接在線粒體膜上替代減少的磷酯,從而維持膜的完整性和穩(wěn)定性。而預(yù)測(cè)為Type B型的OsMGD/02g則主要是在短期低磷脅迫下表達(dá),在長時(shí)間低磷脅迫時(shí)表達(dá)相對(duì)減弱。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q943.2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王力先;王永飛;;三種同源基因的辨析[J];生命的化學(xué);2006年04期

2 海菲;同源基因制造的怪物[J];百科知識(shí);2005年15期

3 成軍,李克,王琳,陸蔭英,劉妍,王剛,張玲霞;豬丙型肝炎病毒核心蛋白結(jié)合蛋白6同源基因的克隆化研究[J];生物學(xué)雜志;2003年04期

4 周春娥;耿■;齊力旺;;梭梭膽堿單氧化物酶基因(CMO)的cDNA克隆[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2007年09期

5 魏于全,田聆;異種同源基因、分子進(jìn)化與腫瘤治療[J];自然科學(xué)進(jìn)展;2002年02期

6 周賢龍;王小蘭;王武源;葛學(xué)軍;;薺菜LEAFY同源基因的克隆與進(jìn)化分析[J];熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào);2006年02期

7 賈貞;趙菲佚;吳存祥;;FT及其同源基因在植物發(fā)育調(diào)控中的多功能效應(yīng)[J];西北植物學(xué)報(bào);2011年12期

8 牛雅靜;王淑慧;黃河;戴思蘭;;甘菊CMO同源基因的分離與表達(dá)分析[J];生物技術(shù)通報(bào);2012年04期

9 羅海瀾;王大勇;夏仁學(xué);;枳PPF-1同源基因的克隆及分析[J];西北植物學(xué)報(bào);2008年01期

10 劉振林,尹偉倫,戴思蘭;新的BADH同源基因:甘菊BADH基因[J];分子植物育種;2005年04期

相關(guān)會(huì)議論文 前9條

1 張可浩;傅玉才;章家新;;單細(xì)胞原生動(dòng)物陰道毛滴蟲中沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源基因克隆及其原核表達(dá)[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)2005年學(xué)術(shù)大會(huì)、青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2005年

2 宋虎衛(wèi);;枇杷成花相關(guān)基因EJTFL1 cDNA的克隆與表達(dá)特性研究[A];中國遺傳學(xué)會(huì)第八次代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要匯編（2004-2008）[C];2008年

3 李全梓;李興國;白書農(nóng);陸文j;張憲省;;風(fēng)信子(Hyacinthus orientalis)HAP2基因的克隆及功能分析[A];全國植物分子生物學(xué)與生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2000年

4 彭建宗;王小菁;;非洲菊PRGL基因的克隆和表達(dá)[A];中國植物學(xué)會(huì)七十五周年年會(huì)論文摘要匯編（1933-2008）[C];2008年

5 曹家樹;王玲平;葉紈芝;向s，

本文編號(hào)：1484296