發(fā)布時間：2018-01-31 04:24

  本文關(guān)鍵詞： 小鼠睪丸 AC3 差異表達(dá)基因 基因芯片 TUNEL　出處：《河北大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：環(huán)化腺苷酸(cyclic adenosine-3'-5' mono-phosphate,簡稱cAMP)是細(xì)胞內(nèi)的一種廣泛的第二信使,其在生物系統(tǒng)中起著廣泛的作用。腺苷酸環(huán)化酶3(AC3)作為cAMP信號通路的主要成員,其功能是將ATP轉(zhuǎn)化為cAMP。AC3缺失會導(dǎo)致cAMP信號通路的破壞,并且伴隨著小鼠的嗅覺障礙、母性關(guān)愛能力下降、肥胖、學(xué)習(xí)與記憶能力下降以及雄性不育。精子的正常形成對于雄性生殖發(fā)育是必須的,并且精子的發(fā)生是一個非常嚴(yán)謹(jǐn)?shù)漠a(chǎn)生成熟精子的過程,必須要經(jīng)歷細(xì)胞的有絲分裂、減數(shù)分裂和精子的形成三個重要階段。轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的基因在特定階段的表達(dá)對精子的發(fā)生過程具有重要的調(diào)控作用。特別是一些重要的變化發(fā)生在精子形成的初期階段,此階段轉(zhuǎn)錄機(jī)制也是最為活躍的。并且AC3在此過程表達(dá),通過AC3基因的失活確定其在生殖細(xì)胞發(fā)育過程中的重要性是十分必要的。但是AC3的缺失對小鼠睪丸中生精細(xì)胞發(fā)育的影響,以及會引起哪些信號通路及其調(diào)控的相關(guān)基因的表達(dá)量的變化,尚未可知。本文以AC3野生型和敲除型小鼠睪丸為實驗材料,首先利用TUNEL染色對小鼠睪丸組織的細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測,結(jié)果表明AC3缺失小鼠的睪丸中細(xì)胞的凋亡指數(shù)顯著增加。隨后采用基因芯片雜交的的方法,篩選AC3缺失后表達(dá)量發(fā)生變化的基因,對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并篩選部分基因進(jìn)行實時熒光定量PCR驗證和免疫熒光染色驗證。結(jié)果表明,以野生型小鼠和敲除型小鼠之間差異表達(dá)倍數(shù)≥2為標(biāo)準(zhǔn),693個基因在AC3缺失的小鼠睪丸中發(fā)生了表達(dá)改變,其中330個基因上調(diào)表達(dá),363個基因下調(diào)表達(dá)。對所獲得的693個基因進(jìn)行基因功能注釋和信號通路分析,注釋分析結(jié)果表明,242個差異基因與分子功能相關(guān),461個差異基因參與生物學(xué)過程,516個差異基因參與細(xì)胞組分功能。與轉(zhuǎn)錄活性、防御反應(yīng)、細(xì)胞粘附、細(xì)胞死亡、免疫反應(yīng)等功能相關(guān)的基因在AC3缺失的小鼠睪丸中都發(fā)生了表達(dá)改變。信號通路分析結(jié)果表明,AC3缺失的小鼠睪丸中差異表達(dá)基因參與的34條信號通路發(fā)生了顯著性改變,包括鈣離子信號通路中7個基因發(fā)生了顯著性變化、嗅覺受體信號通路中28個基因發(fā)生了顯著性改變、軸突向?qū)盘柾分?個基因發(fā)生了顯著性改變以及細(xì)胞連接相關(guān)的5個信號通路共25個基因發(fā)生了改變。本文選擇與AC3基因功能緊密相關(guān)且表達(dá)差異較大的基因采用實時熒光定量PCR的方法驗證。包括:cAMP信號通路成員calml3、olfr1016、olfr1273、olfr711;參與表觀遺傳調(diào)控的相關(guān)基因mettl14、dntt;參與精子運動和獲能相關(guān)基因pxn、defb22、snca、dcc、itgav;細(xì)胞發(fā)育和死亡相關(guān)基因crisp1、ywhaz、irs4、olig2、cyplla1;實時熒光定量PCR結(jié)果表明,這些差異表達(dá)基因在AC3野生型和AC3敲除型小鼠睪丸內(nèi)的表達(dá)趨勢和芯片結(jié)果一致,同樣在AC3缺失的睪丸組織內(nèi)都具有顯著的表達(dá)變化(P0.05)。此外,本芯片結(jié)果還發(fā)現(xiàn)很多和細(xì)胞的死亡相關(guān)的基因的表達(dá)量也發(fā)生了顯著性變化。本研究結(jié)果對AC3敲除雄性小鼠不育機(jī)制的了解具有非常重要的啟示。
[Abstract]:cyclic adenosine - 3 ' -5 5' mono-phosphate,綆，

本文編號：1478186