本文關(guān)鍵詞： 家蠶 衰老 BmFoxO 靶基因　出處：《西南大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：衰老是所有生物體均需經(jīng)歷的多因子參與的復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程,伴隨著一系列衰老相關(guān)的疾病,如神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、骨骼系統(tǒng)疾病和癌癥等的發(fā)生。衰老的進(jìn)程受到進(jìn)化上較為保守的信號(hào)通路所調(diào)控,這為延緩衰老和預(yù)防衰老相關(guān)疾病提供了可能。一些重要且保守的長(zhǎng)壽信號(hào)通路,如胰島素信號(hào)通路、TOR、AMPK、Sirt均需要或部分需要通過(guò)重要的轉(zhuǎn)錄因子FoxO發(fā)揮其作用。FoxO是一個(gè)進(jìn)化上保守的壽命調(diào)節(jié)基因,在酵母、線(xiàn)蟲(chóng)、果蠅與小鼠中上調(diào)FoxO的表達(dá)量都能夠延長(zhǎng)壽命。家蠶BmFoxO基因也能調(diào)控家蠶壽命。由于BmFoxO編碼的蛋白屬于轉(zhuǎn)錄因子,故而需要通過(guò)調(diào)控下游靶基因來(lái)實(shí)現(xiàn)生物學(xué)作用。因此,鑒定BmFoxO的靶基因,尋找下游影響衰老的基因就變得尤為重要。本研究主要基于表達(dá)譜測(cè)序鑒定BmFoxO的靶基因。主要獲得了如下研究結(jié)果:(1)BmFoxO靶基因的篩選將構(gòu)建成功的BmFoxO過(guò)表達(dá)和干涉載體轉(zhuǎn)染家蠶卵巢細(xì)胞系,提取RNA進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序。BmFoxO過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組比較,篩選得到差異表達(dá)基因4144個(gè),其中上調(diào)基因3624個(gè)、下調(diào)基因520個(gè)。BmFoxO干涉組與對(duì)照組比較,篩選得到差異表達(dá)基因4563個(gè),其中上調(diào)基因4240個(gè)、下調(diào)基因323個(gè)。利用維恩圖將兩組基因集取交集后共篩選得到受BmFoxO正向或負(fù)向調(diào)控的靶基因212個(gè)。其中受BmFoxO正向調(diào)控的基因90個(gè),負(fù)向調(diào)控的基因122個(gè)。這些差異表達(dá)基因共參與了54個(gè)信號(hào)通路,涉及代謝、蛋白穩(wěn)態(tài)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、衰老及衰老相關(guān)疾病等。根據(jù)BmFoxO特異性識(shí)別的保守的結(jié)合基序(TTGTTTAC),對(duì)上述的212個(gè)基因的上游3K序列進(jìn)行篩查,得到43個(gè)潛在的BmFoxO直接靶基因。FoxO靶基因在線(xiàn)蟲(chóng)、果蠅和哺乳動(dòng)物中是相對(duì)保守的。從網(wǎng)站NCBI GEO編號(hào)GSE44686獲得果蠅FoxO(dFoxO)的靶基因數(shù)據(jù),與BmFoxO過(guò)表達(dá)組數(shù)據(jù)進(jìn)行同源對(duì)比分析,得到兩個(gè)物種共有的靶基因565個(gè)。這些靶基因參與了100個(gè)信號(hào)通路,涉及代謝、蛋白穩(wěn)態(tài)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)輸與分解、衰老等。將上述所篩選到的43個(gè)BmFoxO潛在的直接靶基因,與dFoxO靶基因進(jìn)行比對(duì)分析,其中有4個(gè)基因是BmFoxO與dFoxO共有的靶基因,39個(gè)是BmFoxO特有的靶基因。結(jié)合功能注釋,我們篩選出2個(gè)BmFoxO與dFoxO共有的可能影響衰老和衰老相關(guān)疾病的靶基因BGIBMGA002618、BGIBMGA000459;3個(gè)BmFoxO特有的可能影響衰老和衰老相關(guān)疾病的靶基因BGIBMGA012030、BGIBMGA009731、BGIBMGA005655。將這5個(gè)基因作為家蠶BmFoxO候選靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。(2)BmFoxO靶基因的驗(yàn)證首先,經(jīng)熒光定量驗(yàn)證了BmFoxO能夠正向或負(fù)向調(diào)控BGIBMGA002618、BGIBMGA000459、BGIBMGA012030、BGIBMGA009731、BGIBMGA005655的表達(dá)水平,過(guò)表達(dá)BmFoxO后,BGIBMGA012030的表達(dá)水平上調(diào)最為顯著,約為對(duì)照組的20倍。其次,截取靶基因上游含有TTGTTTAC基序的調(diào)控序列,進(jìn)行雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,BmFoxO能夠與靶基因上游調(diào)控序列結(jié)合,顯著激活熒光素酶活性。BmFoxO對(duì)BGIBMGA005655的上游序列的調(diào)控活性最高,約為對(duì)照組的30倍,進(jìn)一步對(duì)其上游調(diào)控序列進(jìn)行截短實(shí)驗(yàn),通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn),得到BmFoxO調(diào)控BGIBMGA005655上游核心序列位于上游0.8K。(3)BGIBMGA005655序列分析及功能探索利用生物信息學(xué)對(duì)BGIBMGA005655蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其為亮氨酸富集重復(fù)序列蛋白,具有5個(gè)亮氨酸拉鏈(LRR);系統(tǒng)發(fā)生分析表明,BGIBMGA005655在各物種中廣泛分布。家蠶幼蟲(chóng)5齡3天幼蟲(chóng)組織表達(dá)分析顯示,BGIBMGA005655在家蠶頭、表皮、中腸和后部絲腺高量表達(dá)。成功構(gòu)建了BGIBMGA005655細(xì)胞過(guò)表達(dá)載體pIZ/V5-Red-5655和干涉載體pIZ/V5-Red-SiRNA5655。免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明,BGIBMGA005655表達(dá)的蛋白質(zhì)主要位于細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞中改變BGIBMGA005655表達(dá)水平,未發(fā)現(xiàn)影響細(xì)胞周期與細(xì)胞增殖活力,其具體的生物學(xué)功能還需要深入地研究。綜上所述,本研究篩選得到212個(gè)受BmFoxO正向或負(fù)向調(diào)控的靶基因,其中有43個(gè)為潛在的受BmFoxO直接調(diào)控的靶基因。已確定基因BGIBMGA002618、BGIBMGA000459、BGIBMGA012030、BGIBMGA009731、BGIBMGA005655是受BmFoxO調(diào)控的靶基因。初步發(fā)現(xiàn),BGIBMGA005655不會(huì)對(duì)細(xì)胞周期與細(xì)胞增殖造成影響,其具體的生物學(xué)功能還有待探索。
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【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1470696