本文關(guān)鍵詞： 地中海貧血 肽核酸 PYR復(fù)合體 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 基因治療　出處：《貴州醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:通過(guò)肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)封閉PYR(polypyrimidine complex)的DNA結(jié)合序列(γ-δ基因間序列),人為激活γ-珠蛋白基因的表達(dá),從而探索一條β-地中海貧血基因治療的新途徑。方法:1.肽核酸的設(shè)計(jì):本研究一共設(shè)計(jì)三條肽核酸(1)PYR-PNA,與PYR的DNA結(jié)合序列互補(bǔ)結(jié)合,用于阻斷γ→β珠蛋白開(kāi)關(guān);(2)β-PNA,與β-珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)序列互補(bǔ)結(jié)合,用于下調(diào)β-珠蛋白基因表達(dá);(3)Scr-PNA,即隨機(jī)序列PNA(Scramble PNA),作為隨機(jī)對(duì)照PNA。2.肽核酸的轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞毒性試驗(yàn):以陽(yáng)離子脂質(zhì)體lipofectamine2000為載體,將標(biāo)記有FITC熒光基團(tuán)的PYR-PNA轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算其轉(zhuǎn)染效率,采用Cell Counting Kit(CCK-8)檢測(cè)其細(xì)胞毒性,應(yīng)用正交試驗(yàn)篩選出最佳轉(zhuǎn)染條件,并優(yōu)化稀釋培養(yǎng)基血清濃度,以獲得最優(yōu)的轉(zhuǎn)染效果。3.肽核酸對(duì)γ-珠蛋白基因表達(dá)的影響:首先,對(duì)于K562細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和2個(gè)對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組包括PYR-PNA組,β-PNA組,PYR-PNA+β-PNA組;對(duì)照組包括Scr-PNA組,空白對(duì)照組(無(wú)PNA的脂質(zhì)體)。根據(jù)最佳轉(zhuǎn)染條件,各組PNA經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞,于轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h,用Real Time-PCR和Western blotting分別在轉(zhuǎn)錄水平和合成水平檢測(cè)各組γ-珠蛋白基因的表達(dá),比較各組γ-珠蛋白基因表達(dá)量的差異。結(jié)果:1.細(xì)胞最佳轉(zhuǎn)染條件結(jié)果:以2.5-3×105/mL的細(xì)胞密度接種,每100μl的培養(yǎng)基中加入PNA6.25pmol,PNA與脂質(zhì)體的體積比為1:3.5,稀釋和孵育脂質(zhì)體和PNA時(shí)不加胎牛血清,在轉(zhuǎn)染5h后加入50μl胎牛血清,轉(zhuǎn)染48h效果最好。2.細(xì)胞毒性及轉(zhuǎn)染效率結(jié)果:經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化,K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)到87.2%,細(xì)胞存活率(relative growth rate,RGR)為94.1%。3.Real Time-PCR結(jié)果:PYR-PNA組轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h,γ-珠蛋白基因表達(dá)量比對(duì)照組分別增加1.702倍、2.036倍和1.498倍,與隨機(jī)對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);β-PNA組轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h,γ-珠蛋白基因表達(dá)量比對(duì)照組分別增加1.374倍、1.436倍和1.132倍,與隨機(jī)對(duì)照組比較24h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);PYR-PNA+β-PNA組轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h,γ-珠蛋白基因表達(dá)量與隨機(jī)對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);β-PNA組、PYR-PNA+β-PNA組與PYR-PNA組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。4.Western blotting結(jié)果:PYR-PNA組轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h,γ-珠蛋白表達(dá)量比對(duì)照組分別增加1.608倍、2.488倍和1.575倍,與隨機(jī)對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);β-PNA組轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h,K562細(xì)胞γ-珠蛋白表達(dá)量比對(duì)照組分別增加1.330倍、1.422倍和1.059倍,與隨機(jī)對(duì)照組比較24h(P0.01)、48h(P0.05)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;PYR-PNA+β-PNA組轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h,K562細(xì)胞γ-珠蛋白表達(dá)量比對(duì)照組分別增加1.334倍、1.784倍和1.177倍,與隨機(jī)對(duì)照組比較24h、48h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);β-PNA組、PYR-PNA+β-PNA組與PYR-PNA組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論:1.通過(guò)條件優(yōu)化,PNA可通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞;2.PYR-PNA可顯著提高K562細(xì)胞中γ-珠蛋白基因在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達(dá);3.本研究為進(jìn)一步探索γ-珠蛋白基因表達(dá)機(jī)制及β-地中海貧血基因治療的研究方法提供了新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R556.61

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