本文關(guān)鍵詞： 幽門螺桿菌 侵襲 T4SS cagI cagL cagA　出處：《福建醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一種兼性胞內(nèi)菌,侵入胃黏膜上皮細(xì)胞是H.pylori導(dǎo)致胃黏膜病理改變的機(jī)制之一,但其侵襲機(jī)制尚不明確。β1整合素(integrinβ1)是H.pylori侵襲相關(guān)的細(xì)胞受體,H.pylori的Cag I、Cag L和Cag A均能與之結(jié)合,本實(shí)驗(yàn)室的既往研究已證明Cag L和Cag A均與H.pylori的侵襲功能相關(guān)。已知cag I和cag L是H.pylori IV型分泌系統(tǒng)的重要毒力基因,有研究表明cag I和cag L相互作用形成復(fù)合物,且cag I可影響Cag L的表達(dá)量。因此,本研究擬探究cag I是否與H.pylori侵襲相關(guān),及cag I與cag L和cag A的侵襲細(xì)胞功能強(qiáng)弱是否有別。研究目的在于揭示H.pylori侵襲機(jī)制,為H.pylori致病作用和機(jī)制的研究提供一定的參考意義和新思路。方法:1、構(gòu)建幽門螺桿菌NCTC11637cag I基因缺失株NCTC11637Δcag I根據(jù)NCBI H.pylori J99全基因組序列,設(shè)計(jì)引物,獲得上下游基因片段,運(yùn)用基因敲除同源重組原理將卡那霉素抗性基因(kana R)連接到PCR擴(kuò)增的上下游基因片段cag L和cag H之間,并共同插入到p Bluescript SKⅡ(-)載體,構(gòu)建出帶卡那霉素抗性標(biāo)志的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含完整cag I基因的標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11637中,卡那霉素篩選出cag I基因缺失的幽門螺桿菌突變株,并經(jīng)染色鏡檢,尿素酶及DNA、RNA水平鑒定,獲得正確的缺失株。2、構(gòu)建幽門螺桿菌NCTC11637cag L/I雙基因缺失株NCTC11637Δcag L/I根據(jù)NCBI H.pylori J99全基因序列,設(shè)計(jì)引物,獲得上下游基因片段,運(yùn)用基因敲除同源重組原理將卡那霉素抗性基因(kana R)連接到PCR擴(kuò)增的上下游基因片段cag N和cag H之間,并共同插入到p Bluescript SKⅡ(-)載體,構(gòu)建出帶卡那霉素抗性標(biāo)志的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含完整cag L和cag I基因的標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11637中,卡那霉素篩選出cag L和cag I基因缺失的幽門螺桿菌突變株,并經(jīng)染色鏡檢,尿素酶及DNA、RNA水平鑒定,獲得正確的缺失株。3、cag I、cag L及cag A基因的表達(dá)量檢測設(shè)H.pylori NCTC11637Δcag I、NCTC11637Δcag L(已由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)和NCTC11637Δcag A(已由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)為實(shí)驗(yàn)組,H.pylori NCTC11637為對照組,分別提取RNA,并逆轉(zhuǎn)錄成c DNA,以c DNA為模板,采用q RT-PCR方法分別測定cag I、cag L及cag A基因的表達(dá)量。4、慶大霉素保護(hù)性侵襲實(shí)驗(yàn)以H.pylori NCTC11637Δcag I、NCTC11637Δcag L、NCTC11637Δcag L/I、NCTC11637Δcag A和NCTC11637分別感染AGS細(xì)胞(MOI=50,MOI為細(xì)菌數(shù)和細(xì)胞數(shù)的比值);一組細(xì)胞于感染2h后洗滌裂解,將裂解物涂布細(xì)菌培養(yǎng)板,培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),此為粘附細(xì)胞細(xì)菌數(shù),計(jì)算粘附率(粘附細(xì)胞菌數(shù)/感染細(xì)胞菌數(shù)×100%);另一組細(xì)胞于感染2h后進(jìn)行慶大霉素保護(hù)性侵襲實(shí)驗(yàn)(2h),裂解細(xì)胞,裂解物涂布細(xì)菌培養(yǎng)板,培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),此為侵入細(xì)胞菌數(shù),計(jì)算侵襲粘附比(侵入細(xì)胞菌數(shù)/粘附細(xì)胞菌數(shù)×100%)。5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS22.0進(jìn)行非參數(shù)秩和檢驗(yàn)分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果:1、成功構(gòu)建了幽門螺桿菌NCTC11637cag I缺失株(NCTC11637Δcag I)及NCTC11637 cag L/I缺失株(NCTC11637Δcag L/I)。2、cag I、cag L及cag A基因在NCTC11637Δcag I、NCTC11637Δcag L和NCTC11637Δcag A中的表達(dá)量NCTC11637Δcag I的cag I、cag L、cag A基因表達(dá)量分別為0.00179±0.00044、0.00385±0.0032、0.93830±0.0276,與NCTC11637相比,NCTC11637Δcag I的cag I和cag L基因表達(dá)量降低,cag A基因表達(dá)量不變;NCTC11637Δcag L的cag I、cag L、cag A基因表達(dá)量分別為0.97391±0.35477、0.00261±0.00204、0.79419±0.12600,與NCTC11637相比,NCTC11637Δcag L的cag L基因表達(dá)量顯著降低,cag I和cag A基因表達(dá)量不變;NCTC11637Δcag A的cag I、cag L、cag A基因表達(dá)量分別為1.00621±0.47831、1.00233±0.50291、0.000012±0.000008,與NCTC11637相比,NCTC11637Δcag A的cag A基因表達(dá)量顯著降低,cag I和cag L基因表達(dá)量不變。3、慶大霉素保護(hù)性侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果H.pylori NCTC11637Δcag I、NCTC11637Δcag L、NCTC11637Δcag L/I、NCTC11637Δcag A和NCTC11637對AGS細(xì)胞侵襲粘附比分別為7.88±0.82%、5.88±1.52%、5.43±1.54%、4.62±1.29%、20.41±5.77%,經(jīng)非參數(shù)秩和檢驗(yàn)分析:NCTC11637Δcag I、NCTC11637Δcag L、NCTC11637Δcag L/I及NCTC11637Δcag A的侵襲粘附比均顯著低于NCTC11637(P0.05);NCTC11637Δcag I分別與NCTC11637Δcag L、NCTC11637Δcag L/I的侵襲粘附比均無顯著性差異(P0.05);NCTC11637Δcag L與NCTC11637Δcag L/I的侵襲粘附比無顯著性差異(P0.05);NCTC11637Δcag L與NCTC11637Δcag A侵襲粘附比無顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:1、cag I在基因轉(zhuǎn)錄水平影響了cag L的表達(dá)。2、cag I與幽門螺桿菌侵襲細(xì)胞功能相關(guān)。3、幽門螺桿菌cag I、cag L及cag A細(xì)胞侵襲能力無強(qiáng)弱差異,但可能起主要作用的侵襲因子是cag A。
[Abstract]:Objective : To investigate whether cag I and cag A were involved in the invasion of H . pylori . A recombinant plasmid containing cag L and cag I was isolated by PCR . The recombinant plasmid was transformed into standard strain NCTC11637 containing intact cag L and cag I gene . The expression of cag I , cag L , cag A gene in NCTC11637 螖cag I , NCTC11637 螖cag I , NCTC11637 螖cag I , cag I , cag L , cag A were 0.00179 鹵 0.47831 , 0.00233 鹵 0.50291 , 0.000012 鹵 0.000008 , respectively . The invasive adhesion ratio of NCTC11637 螖cag I , NCTC11637 螖cag L , NCTC11637 螖cag A and NCTC11637 螖cag A was significantly lower than that of NCTC11637 螖cag I , NCTC11637 螖cag L , NCTC11637 螖cag L / I and NCTC11637 螖cag A .

【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R573

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1 陳楚;幽門螺桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)cagI基因細(xì)胞侵襲功能研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2016年

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本文編號：1458913