本文關(guān)鍵詞： RT-qPCR 內(nèi)參基因 魔芋 HSFA1 基因表達(dá)　出處：《西南大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(RT-qPCR)目前是分析基因表達(dá)的常用方法,而穩(wěn)定的內(nèi)參基因是準(zhǔn)確定量基因表達(dá)水平的先決條件。魔芋是我國(guó)西南地區(qū)的一類價(jià)值較高的蔬菜作物,研究魔芋中一些重要的功能基因?qū)δв筮z傳改良有重大幫助。由于基因組數(shù)據(jù)的限制,魔芋中尚未篩選出穩(wěn)定的內(nèi)參基因,內(nèi)參基因的篩選能夠?yàn)楹罄m(xù)重要功能基因的表達(dá)分析提供重要的理論支撐,有著重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。此外,魔芋是一種不耐熱的作物,目前只適應(yīng)在中高海拔地區(qū)種植,研究魔芋熱害脅迫下主調(diào)控因子Heat shock transcription factor A1(HSFA1)基因的表達(dá)情況,有助于了解魔芋的耐熱調(diào)控機(jī)制,對(duì)魔芋耐熱改良有重要的理論幫助。以白魔芋(Amorphophallus albus)和花魔芋(Amorphophallus konjac)為試材,采用同源克隆法,克隆了包括Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)、Elongation factor 1-α(EF1-a)、Eukaryotic initiation factor 4A(EIF4A)、H3.2 histones(H3)、Cyclophilin(CYP)、β-Actin(ACTB)、β-Tubulin(TUB)、Ubiquitin(UBQ)、Ribosomal protein L16(RP)在內(nèi)的9個(gè)候選內(nèi)參基因及HSFA1基因保守區(qū)部分序列,鑒定了候選內(nèi)參基因在熱害脅迫、雨澇脅迫及不同組織間表達(dá)的穩(wěn)定性,通過cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)獲得了HSFA1基因的全長(zhǎng),預(yù)測(cè)了其編碼讀碼框,并通過洋蔥表皮亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)鑒定了魔芋HSFA1基因的亞細(xì)胞定位模式。同時(shí)以篩選出的穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合作為內(nèi)部對(duì)照,分析了兩個(gè)魔芋種的不同組織中(葉和根)HSFA1基因在41℃高溫處理0-8 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)情況。主要結(jié)果如下:1、克隆了白魔芋、花魔芋中9個(gè)內(nèi)參基因采用同源克隆法,根據(jù)NCBI中親緣關(guān)系較近物種的同源保守序列,從兩個(gè)魔芋種中克隆出其他作物中9個(gè)常用內(nèi)參基因(GADPH、ACTB、RP、UBQ、H3、TUB、CYP、EIF4A、EF1-α)的編碼區(qū)保守性片段。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,預(yù)測(cè)了編碼的氨基酸殘基,通過構(gòu)建發(fā)育樹,比較了物種之間的親緣關(guān)系,結(jié)果顯示,與魔芋親緣關(guān)系最近的是天南星科中的花燭等植物,這些植物與魔芋同科,此外與魔芋親緣關(guān)系較近的還有單子葉植物棕櫚科的非洲油棕(Elaeis guineensis)、海棗(Phoenix dactylifera)及芭蕉科的野生芭蕉亞種(Musa acuminata subsp.)等,這為魔芋相關(guān)基因的同源克隆提供了借鑒。2、比較了三種實(shí)驗(yàn)條件下兩個(gè)魔芋種中穩(wěn)定的內(nèi)參基因應(yīng)用RT-qPCR技術(shù),設(shè)計(jì)定量引物,計(jì)算了不同組織間、熱害脅迫及雨澇脅迫下候選內(nèi)參基因表達(dá)Cq值。根據(jù)geNorm、NormFinder、BestKeeper三個(gè)算法計(jì)算了不同候選基因的穩(wěn)定值,并比較了穩(wěn)定值結(jié)果,鑒定了不同實(shí)驗(yàn)情況下(熱害脅迫、雨澇脅迫及不同組織間)兩個(gè)魔芋種中穩(wěn)定內(nèi)參基因。結(jié)果表明EF1-α和EIF4A是所有集合中最穩(wěn)定的2個(gè)內(nèi)參基因,EF1-α、EIF4A、H3和UBQ是熱害脅迫下較穩(wěn)定的內(nèi)參基因;EF1-α、EIF4A和TUB是雨澇脅迫下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因;EF1-α、EIF4A和CYP是不同組織間最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。3、分離到兩個(gè)魔芋種的HSFA1基因依據(jù)保守氨基酸序列和密碼子的偏好性,設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,分離得到長(zhǎng)1221 bp的基因片段。利用RACE技術(shù)分離到魔芋HSFA1上游及下游片段,拼接結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因全長(zhǎng)為1909 bp,ORF finder預(yù)測(cè)了1569 bp的開放閱讀框,編碼了522個(gè)氨基酸殘基,通過設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物,驗(yàn)證了RACE擴(kuò)增結(jié)果準(zhǔn)確性。結(jié)構(gòu)域分析顯示該基因具備與其他物種HSFA1基因相似的結(jié)構(gòu)域,C端含有AHA基序,能夠激活下游基因表達(dá);生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其與單子葉植物的親緣關(guān)系較近,但相似度均在81%以下;跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)其不含有跨膜結(jié)構(gòu)。4、分析了兩個(gè)蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中的定位情況通過構(gòu)建pCHF3-AkHSFA1-YFP和pCHF3-AaHSFA1-YFP融合表達(dá)載體,確定了在洋蔥表皮細(xì)胞的定位情況,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)蛋白主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。5、鑒定了兩個(gè)魔芋種中HSFA1基因不同組織的相對(duì)表達(dá)模式對(duì)魔芋材料41℃高溫處理,應(yīng)用RT-qPCR技術(shù),以EF1-α+H3+UBQ作為內(nèi)參基因,分析了0-8 h HSFA1基因在白魔芋和花魔芋葉片和根兩個(gè)組織中表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)HSFA1的表達(dá)水平在2個(gè)中整體呈現(xiàn)出增強(qiáng)的趨勢(shì),均在熱處理2 h時(shí)表達(dá)達(dá)到頂峰,說明了魔芋為熱敏感型作物;不同組織間比較發(fā)現(xiàn),該基因在葉片中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于根中,表明HSFA1在葉片中的表達(dá)豐度高;兩個(gè)種之間的表達(dá)量比較發(fā)現(xiàn),AaHSFA1的表達(dá)量在不同時(shí)段均高于AkHSFA1,從分子生物學(xué)角度進(jìn)一步說明了白魔芋耐熱性強(qiáng)于花魔芋。綜上,本研究的結(jié)果為魔芋基因表達(dá)分析與耐熱調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析提供了重要的理論參考及技術(shù)支持。
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【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S632.3

【參考文獻(xiàn)】

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