發(fā)布時(shí)間：2018-01-22 20:07

  本文關(guān)鍵詞： IRES 載體構(gòu)建 基因共表達(dá) MDCK細(xì)胞 siat7e基因　出處：《聊城大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：科學(xué)研究中構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,抗體工程和細(xì)胞工程領(lǐng)域篩選種子細(xì)胞經(jīng)常需要兩個(gè)或以上的基因穩(wěn)定共表達(dá)。通常通過兩個(gè)載體共轉(zhuǎn)染的篩選方法來實(shí)現(xiàn),然而實(shí)踐中常面對許多問題。因此,有必要開發(fā)單個(gè)載體實(shí)現(xiàn)多基因共同表達(dá)。MDCK細(xì)胞作為流感病毒疫苗生產(chǎn)的重要細(xì)胞系之一,廣泛應(yīng)用于多種病毒的擴(kuò)增與純化。但是MDCK細(xì)胞貼壁依賴性強(qiáng),需要表面粘附來進(jìn)行增殖。因此實(shí)現(xiàn)MDCK細(xì)胞于懸浮培養(yǎng)中增殖,將簡化病毒生產(chǎn)過程,并極大地促進(jìn)流感病毒的生產(chǎn)規(guī)模。本文第一部分是基于IRES序列的多基因共穩(wěn)定表達(dá)篩選載體構(gòu)建。目的:構(gòu)建一個(gè)IRES序列介導(dǎo)的多基因共表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)兩個(gè)目的基因和篩選標(biāo)記基因共用一個(gè)啟動子高效表達(dá),提高多基因穩(wěn)定共表達(dá)細(xì)胞株的篩選效率。方法:以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的載體pLV-MCS-Puro為骨架,設(shè)計(jì)并全基因合成雙基因克隆表達(dá)元件,連接到骨架載體,構(gòu)建多基因共表達(dá)載體pLV-2MCS-Puro,以DsRed2和EGFP熒光蛋白基因驗(yàn)證該載體用于多基因穩(wěn)定共表達(dá)細(xì)胞株篩選的效率。結(jié)果:成功構(gòu)建了pLV-2MCS-Puro載體以及DsRed2和EGFP共表達(dá)重組質(zhì)粒pLV-DsRed2-EGFP-Puro。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明該載體能介導(dǎo)多基因共表達(dá)�？剐院Y選獲得了MDCK和Hela兩種細(xì)胞的多基因穩(wěn)定共表達(dá)細(xì)胞池。細(xì)胞池涂片熒光顯微鏡觀察和計(jì)數(shù)表明抗性細(xì)胞池DsRed2和EGFP雙陽率接近100%�；蚪M和轉(zhuǎn)錄水平PCR及蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明DsRed2和EGFP穩(wěn)定整合到抗性細(xì)胞基因組并且兩種蛋白表達(dá)水平較為一致。結(jié)論:成功構(gòu)建了多基因共表達(dá)載體pLV-2MCS-Puro,實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)目的基因和抗性基因串聯(lián)共表達(dá),并且具有高效的多基因穩(wěn)定共表達(dá)細(xì)胞株篩選效率。該載體在研究蛋白相互作用以及工程細(xì)胞構(gòu)建等方面具有一定的應(yīng)用前景。本文第二部分是siat7e基因穩(wěn)定表達(dá)的MDCK細(xì)胞株的構(gòu)建。目的:本章節(jié)擬構(gòu)建表達(dá)siat7e的MDCK細(xì)胞株,用以解決MDCK細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)問題。方法:利用PCR技術(shù),從MDCK細(xì)胞基因組中擴(kuò)增出全長1011bp的siat7e基因,并將該基因分別克隆到pBflag、pLV-MCS-Puro和pSF-EGFP表達(dá)載體中,三種真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞后,篩選siat7e基因穩(wěn)定表達(dá)的MDCK細(xì)胞株,以期實(shí)現(xiàn)MDCK細(xì)胞適應(yīng)無血清懸浮培養(yǎng)。結(jié)果:成功構(gòu)建了pBflag-siat7e、pLV-siat7e-Puro、pSF-EGFP-siat7e三種表達(dá)質(zhì)粒。pBflag-siat7e重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞,抗性篩選獲得四個(gè)克隆,蛋白質(zhì)印記和基因組PCR未見siat7e目的條帶,推測可能未篩選到siat7e陽性克隆,且細(xì)胞未見明顯表型。pLV-siat7e-Puro重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞,抗性篩選獲得MDCK耐藥細(xì)胞池。基因組和轉(zhuǎn)錄水平PCR都證明目的基因siat7e穩(wěn)定整合到MDCK細(xì)胞基因組。同樣細(xì)胞未見明顯表型,降低血清或者無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)耐藥性MDCK細(xì)胞,未獲得適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系。利用pSF-EGFP-siat7e重組載體,融合表達(dá)EGFP和siat7e蛋白,熒光定位siat7e蛋白。熒光倒置顯微鏡下觀察EGFP熒光蛋白表達(dá)情況,驗(yàn)證siat7e基因成功轉(zhuǎn)染至MDCK細(xì)胞。基因組和轉(zhuǎn)錄水平PCR驗(yàn)證,證明siat7e基因穩(wěn)定整合到MDCK細(xì)胞基因組。蛋白熒光定位驗(yàn)證siat7e表達(dá)的唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。結(jié)論:成功構(gòu)建了三種表達(dá)質(zhì)粒,并成功篩選獲得兩種穩(wěn)定表達(dá)siat7e基因的MDCK耐藥細(xì)胞池,且成功驗(yàn)證唾液酸轉(zhuǎn)移酶蛋白定位,但細(xì)胞未見明顯表型。接下來,將進(jìn)一步研究重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后MDCK細(xì)胞適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的特性。本研究構(gòu)建的siat7e基因真核表達(dá)載體,在轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞后,若能使MDCK細(xì)胞適應(yīng)懸浮培養(yǎng),將極方便應(yīng)用MDCK細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)流感病毒疫苗。
[Abstract]:A recombinant plasmid pLV - 2MCS - Puro has been successfully constructed . Two stable MDCK cells stably expressing siat7e gene were successfully screened , and the siat7e gene was successfully verified . However , the cells did not meet the obvious phenotype . Next , we will further study the characteristics of MDCK cells in suspension culture . After transfection of MDCK cells , MDCK cells can be used for suspension culture , and MDCK cells can be used to produce influenza virus vaccine on a large scale .

【學(xué)位授予單位】：聊城大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

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本文編號：1455632