本文關鍵詞： IRES 載體構建 基因共表達 MDCK細胞 siat7e基因　出處：《聊城大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：科學研究中構建穩(wěn)定表達細胞株,抗體工程和細胞工程領域篩選種子細胞經常需要兩個或以上的基因穩(wěn)定共表達。通常通過兩個載體共轉染的篩選方法來實現,然而實踐中常面對許多問題。因此,有必要開發(fā)單個載體實現多基因共同表達。MDCK細胞作為流感病毒疫苗生產的重要細胞系之一,廣泛應用于多種病毒的擴增與純化。但是MDCK細胞貼壁依賴性強,需要表面粘附來進行增殖。因此實現MDCK細胞于懸浮培養(yǎng)中增殖,將簡化病毒生產過程,并極大地促進流感病毒的生產規(guī)模。本文第一部分是基于IRES序列的多基因共穩(wěn)定表達篩選載體構建。目的:構建一個IRES序列介導的多基因共表達載體,實現兩個目的基因和篩選標記基因共用一個啟動子高效表達,提高多基因穩(wěn)定共表達細胞株的篩選效率。方法:以實驗室前期構建的載體pLV-MCS-Puro為骨架,設計并全基因合成雙基因克隆表達元件,連接到骨架載體,構建多基因共表達載體pLV-2MCS-Puro,以DsRed2和EGFP熒光蛋白基因驗證該載體用于多基因穩(wěn)定共表達細胞株篩選的效率。結果:成功構建了pLV-2MCS-Puro載體以及DsRed2和EGFP共表達重組質粒pLV-DsRed2-EGFP-Puro。瞬時轉染實驗證明該載體能介導多基因共表達�？剐院Y選獲得了MDCK和Hela兩種細胞的多基因穩(wěn)定共表達細胞池。細胞池涂片熒光顯微鏡觀察和計數表明抗性細胞池DsRed2和EGFP雙陽率接近100%�；蚪M和轉錄水平PCR及蛋白免疫印跡實驗表明DsRed2和EGFP穩(wěn)定整合到抗性細胞基因組并且兩種蛋白表達水平較為一致。結論:成功構建了多基因共表達載體pLV-2MCS-Puro,實現了兩個目的基因和抗性基因串聯共表達,并且具有高效的多基因穩(wěn)定共表達細胞株篩選效率。該載體在研究蛋白相互作用以及工程細胞構建等方面具有一定的應用前景。本文第二部分是siat7e基因穩(wěn)定表達的MDCK細胞株的構建。目的:本章節(jié)擬構建表達siat7e的MDCK細胞株,用以解決MDCK細胞的懸浮培養(yǎng)問題。方法:利用PCR技術,從MDCK細胞基因組中擴增出全長1011bp的siat7e基因,并將該基因分別克隆到pBflag、pLV-MCS-Puro和pSF-EGFP表達載體中,三種真核表達載體轉染MDCK細胞后,篩選siat7e基因穩(wěn)定表達的MDCK細胞株,以期實現MDCK細胞適應無血清懸浮培養(yǎng)。結果:成功構建了pBflag-siat7e、pLV-siat7e-Puro、pSF-EGFP-siat7e三種表達質粒。pBflag-siat7e重組質粒轉染MDCK細胞,抗性篩選獲得四個克隆,蛋白質印記和基因組PCR未見siat7e目的條帶,推測可能未篩選到siat7e陽性克隆,且細胞未見明顯表型。pLV-siat7e-Puro重組質粒轉染MDCK細胞,抗性篩選獲得MDCK耐藥細胞池�；蚪M和轉錄水平PCR都證明目的基因siat7e穩(wěn)定整合到MDCK細胞基因組。同樣細胞未見明顯表型,降低血清或者無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)耐藥性MDCK細胞,未獲得適應懸浮培養(yǎng)的MDCK細胞系。利用pSF-EGFP-siat7e重組載體,融合表達EGFP和siat7e蛋白,熒光定位siat7e蛋白。熒光倒置顯微鏡下觀察EGFP熒光蛋白表達情況,驗證siat7e基因成功轉染至MDCK細胞�；蚪M和轉錄水平PCR驗證,證明siat7e基因穩(wěn)定整合到MDCK細胞基因組。蛋白熒光定位驗證siat7e表達的唾液酸轉移酶蛋白定位在內質網上。結論:成功構建了三種表達質粒,并成功篩選獲得兩種穩(wěn)定表達siat7e基因的MDCK耐藥細胞池,且成功驗證唾液酸轉移酶蛋白定位,但細胞未見明顯表型。接下來,將進一步研究重組質粒轉化后MDCK細胞適應懸浮培養(yǎng)的特性。本研究構建的siat7e基因真核表達載體,在轉染MDCK細胞后,若能使MDCK細胞適應懸浮培養(yǎng),將極方便應用MDCK細胞大規(guī)模生產流感病毒疫苗。
[Abstract]:A recombinant plasmid pLV - 2MCS - Puro has been successfully constructed . Two stable MDCK cells stably expressing siat7e gene were successfully screened , and the siat7e gene was successfully verified . However , the cells did not meet the obvious phenotype . Next , we will further study the characteristics of MDCK cells in suspension culture . After transfection of MDCK cells , MDCK cells can be used for suspension culture , and MDCK cells can be used to produce influenza virus vaccine on a large scale .

【學位授予單位】：聊城大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

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本文編號：1455632