本文關(guān)鍵詞： 宏基因組 功能篩選 酯酶 非水相催化 轉(zhuǎn)酯反應(yīng)　出處：《華東理工大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：自然環(huán)境中微生物分布廣泛,種類繁多,蘊(yùn)含著豐富的基因資源,但99%的微生物在目前實(shí)驗(yàn)條件下不易獲得純培養(yǎng),宏基因組學(xué)不依賴微生物培養(yǎng),提供了一個(gè)獲取寶貴未培養(yǎng)微生物遺傳資源的途徑。酯酶作為一大類水解酶,廣泛應(yīng)用于不同的領(lǐng)域,具有很高的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,在生物催化方面展現(xiàn)出巨大的潛力。不同于脂肪酶,只有少數(shù)的酯酶應(yīng)用于有機(jī)合成中。因而,利用豐富的微生物資源去開發(fā)新型且具有優(yōu)良特性的酯酶,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和工業(yè)應(yīng)用價(jià)值�；谝陨夏康�,本研究致力于新型酯酶基因的開發(fā),利用宏基因組學(xué)的方法對(duì)深海污泥中的酯酶基因進(jìn)行篩選和分析,從中篩選得到了一個(gè)具有高活力和立體選擇性的新型酯酶EST4,基于開發(fā)和實(shí)際應(yīng)用的目的,將其成功用于在非水相中催化動(dòng)力學(xué)拆分反應(yīng)和用于合成工業(yè)上重要的乙酸酯類化合物,并通過固定化技術(shù)提高其催化穩(wěn)定性。酯酶EST4顯示的獨(dú)特性質(zhì)和良好的催化效果,證明是一個(gè)非常具有潛力的生物催化劑。具體研究結(jié)果如下：(1)本課題首先對(duì)深海污泥直接提取基因組用于構(gòu)建Fosmid文庫,庫容量約40,000個(gè)克隆�；诠δ芑钚缘暮Y選方法,對(duì)該文庫進(jìn)行酯酶活性篩選,從中得到了34個(gè)陽性克隆表現(xiàn)出酯水解活性。通過對(duì)Fosmid質(zhì)粒構(gòu)建亞克隆文庫的方法,最終獲得5個(gè)新型的酯酶基因；將5個(gè)酯酶基因與NCBI數(shù)據(jù)庫上已報(bào)道的脂類水解酶的氨基酸序列比對(duì),其最高同源性在48%至79%之間。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,5個(gè)酯酶分別隸屬于3個(gè)不同的酯酶/脂肪酶家族(Family IV, Family V和Family VIII)。這些新型的酯酶為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了材料。(2)對(duì)5個(gè)新型酯酶進(jìn)行克隆并成功在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)。以三丁酸甘油酯為底物進(jìn)行活性篩選,得到水解活性最高的酯酶EST4。通過酶學(xué)性質(zhì)研究表明：EST4偏好作用于短�；滈L(zhǎng)(C2～C10)的對(duì)硝基苯酚酯,以對(duì)硝基苯基丁酸酯水解活性最高；最適水解溫度為45℃,最適pH為8.0,水解比活為1389 U/mg；EST4在45℃的半衰期為46 h,具有較好的熱穩(wěn)定性；表面活性劑和金屬離子均對(duì)EST4的活性無促進(jìn)作用,是不依賴金屬離子的酯酶；同時(shí)在有機(jī)溶劑中表現(xiàn)出良好的耐受性,尤其是在疏水性溶劑中,30℃處理12 h后仍然保持90%以上殘余酶活。酶學(xué)特性研究為EST4的工業(yè)化應(yīng)用提供了一定的基礎(chǔ),尤其是有機(jī)溶劑耐受性和熱穩(wěn)定性方面,對(duì)于非水相催化非常有利,為后續(xù)的催化反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。(3)光學(xué)純的仲醇作為一類重要的手性中間體,是生產(chǎn)藥物的重要手性砌塊,可以轉(zhuǎn)化為重要的生物活性分子,利用酯酶催化手性化合物拆分制備光學(xué)純手中間體是一種有效途徑。以α-苯乙醇為模式底物,通過優(yōu)化酯酶EST4拆分反應(yīng)的關(guān)鍵性因素,最終確定了在正己烷中,以丁酸乙烯酯為�；w,在30℃下,10mg/mL投酶量,底物與酰基供體摩爾比1：3時(shí),EST4能發(fā)揮最高催化特性同時(shí)能獲得大于99.9%ee底物醇且E200。EST4在動(dòng)力學(xué)拆分中表現(xiàn)出非常廣的底物譜,基于轉(zhuǎn)酯反應(yīng),在最優(yōu)反應(yīng)條件下,EST4能高效拆分α-苯乙醇衍生物、不同側(cè)鏈長(zhǎng)度的芳香醇和雜環(huán)醇(鄰位取代α-苯乙醇衍生物除外),底物ee值大于99.9%,一半以上底物E值大于200。此外,為考察工業(yè)應(yīng)用潛力,在高底物濃度下利用EST4進(jìn)行拆分反應(yīng),EST4表現(xiàn)出高底物濃度耐受性,濃度至1M時(shí),仍然能獲得大于99%ee的手性醇同時(shí)轉(zhuǎn)化率接近理論轉(zhuǎn)化率50%。酯酶EST4表現(xiàn)出對(duì)仲醇的高活性和高對(duì)映選擇性,使其成為工業(yè)化生產(chǎn)手性中間體的潛在用酶。(4)乙酸酯類化合物作為重要的香精香料分子,具有典型的水果香味和高揮發(fā)性,被廣泛應(yīng)用于食品和化妝品行業(yè)。以EST4的凍干細(xì)胞作為全細(xì)胞催化劑,用于催化乙酸酯類化合物的合成反應(yīng),其最優(yōu)條件為：以log P 3.5的正己烷為反應(yīng)介質(zhì),乙酸乙烯酯為�；w,底物摩爾比為1：2,在40℃下,反應(yīng)90 min,即可將100 mM肉桂醇100%轉(zhuǎn)化完全；同時(shí),EST4對(duì)肉桂醇底物具有良好的耐受性,在2.5M(335g/L)濃度下依然能保持高催化活性,且反應(yīng)12h內(nèi)轉(zhuǎn)化率大于98%,有效緩解生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的底物產(chǎn)物抑制現(xiàn)象；除肉桂醇外,EST4對(duì)其他類型的醇同樣能耐受較高的濃度,對(duì)2.0 M香茅醇和3.0 M異戊醇反應(yīng)12h后的轉(zhuǎn)化率可達(dá)97%以上。底物譜研究發(fā)現(xiàn),EST4對(duì)不同結(jié)構(gòu)類型的伯醇、仲醇具有較高的轉(zhuǎn)酯活性,是一個(gè)非常適合轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的廣譜底物適應(yīng)性酯酶,具有廣泛的應(yīng)用性。(5)在酯酶EST4共價(jià)固定化研究方面,首先通過硫酸銨沉淀的方法對(duì)EST4粗酶液進(jìn)行純化和回收并對(duì)其濃度進(jìn)行優(yōu)化,最終確定50%(w/v)的硫酸銨濃度,酶活收率高于98%；選取不同類型的氨基和環(huán)氧基載體,以酶活和固定化效率為篩選標(biāo)準(zhǔn),篩選得到了最佳氨基載體NH；通過單因素優(yōu)化固定化條件,確定了氨基載體NH固定化EST4的最佳條件：100 mM pH8.0磷酸鹽緩沖液,在20℃ 200 rpm下,每克載體20 mg的蛋白量固定3 h。以肉桂醇的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)為研究對(duì)象,對(duì)固定化酶的操作穩(wěn)定性進(jìn)行研究,結(jié)果表明,固定化酶在連續(xù)反應(yīng)11個(gè)批次后,仍然保持90%以上的殘余酶活,提高了其在生物催化過程的穩(wěn)定性,有望在生物合成和有機(jī)合成領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。
[Abstract]:A novel esterase EST4 with high activity and stereoselectivity has been screened and analyzed . The results showed that EST4 had the highest hydrolytic activity , the optimum hydrolysis temperature was 45 鈩，

本文編號(hào)：1455129