本文關鍵詞： 乳液不對稱PCR 乳液單引物PCR 兩步乳液PCR 乳液PCR ssDNA文庫 P16基因 甲基化 乙型肝炎病毒　出處：《江蘇大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：乳液PCR是單分子PCR技術,通過油相的阻隔,把水相間隔成數(shù)目龐大的小水滴,這些小水滴構成了獨立的PCR反應空間,最理想的狀態(tài)下每個小水滴中只含有1個DNA模板,此時小水滴中的PCR反應不會受到競爭干擾。乳液PCR的優(yōu)點是:(1)抗干擾能力強;(2)能消除競爭抑制;(3)高通量和高效率;(4)靈敏度高;(5)絕對定量。本課題利用乳液PCR的特點,建立了高效構建次級ssDNA文庫的乳液不對稱PCR和乳液單引物PCR方法。同時還建立了用于臨床檢驗診斷的高靈敏度的兩步乳液PCR法,并用初步應用到結直腸癌患者血清游離P16基因甲基化水平和乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒核酸的檢測中。第一部分建立和優(yōu)化乳液不對稱PCR高效構建隨機ssDNA文庫目的:建立并優(yōu)化乳液不對稱PCR來構建ssDNA次級文庫。方法:乳液不對稱PCR通過乳液顆粒把不同種類的模板隔開形成單分子PCR,每個模板分開擴增互不影響,不會形成非特異性雜交。以ssDNA文庫為模板的乳液不對稱 PCR 100μl 體系含 50 mmol/L KC1、10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.6),2.5mmol/LMgC12、0.5mmol/LdNTP、0.4 μmol/L 上游引物、0.02μmol/L下游引物、0.04μg/mL模板和0.1U/μLpfuDNA聚合酶。優(yōu)化實驗時,模板濃度優(yōu)化范圍從0.0004 μg/mL到40 μg/mL ,上游引物濃度從0.2 μmol/L到1μmol/L,下游引物濃度從0.0025 μmol/L到0.02μmol/L。擴增反應條件為94℃變性30 s,然后進入35個循環(huán)94 ℃變性40 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,最后延伸3 min。優(yōu)化循環(huán)數(shù)從10到50個循環(huán)。擴增結束破乳液回收產(chǎn)物,并進行聚丙烯酰氨凝膠電泳和銀染,對產(chǎn)物進行分析。對破乳液回收產(chǎn)物同時進行純化回收,并用磁珠分離出ssDNA文庫,檢測濃度。同時對乳液不對稱PCR與常規(guī)不對稱PCR進行對比研究。結果:常規(guī)不對稱PCR擴增ssDNA文庫,在25個循環(huán)即有明顯副產(chǎn)物出現(xiàn),30個循環(huán)時出現(xiàn)明顯的涂抹帶,25個循環(huán)后dsDNA產(chǎn)物量隨著循環(huán)數(shù)的增加逐漸減弱,只至消失,后期不對稱PCR擴增無模板可用,只有非特異性擴增,只產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。因為25個循環(huán)即有明顯副產(chǎn)物出現(xiàn),用磁珠分離的ssDNA文庫不純,因此只分離檢測10、15和20個循環(huán)時的濃度,分別為0.76,1.43和2.02 μg/mL。乳液不對稱PCR在從10到50個循環(huán)中均無副產(chǎn)物,只有ssDNA條帶和dsDNA條帶,且dsDNA條帶無明顯減少,磁珠分離10、15、20、25、30、35、40、45和50循環(huán)數(shù)的產(chǎn)物濃度分別為0.58、1.22、1.78、2.25、3.21、4.32、6.43、6.71和6.55μg/mL產(chǎn)物量明顯多于常規(guī)不對稱PCR。在優(yōu)化乳液不對稱PCR時,首先優(yōu)化模板濃度。當模板濃度從0.0004μg/mL到0.04 μg/mL時產(chǎn)物量隨模板濃度增高而增多,再增加模板濃度產(chǎn)物量無明顯變化,當模板濃度為4 μg/mL時,副產(chǎn)物與產(chǎn)物呈涂抹帶,無法分離。模板濃度為0.04～0.4μg/mL時,無肉眼可見副產(chǎn)物,ssDNA產(chǎn)物量也足夠多,在模板濃度為0.4 μg/mL時,dsDNA濃度明顯下降。因此模板濃度在0.04μg/mL到0.4 μg/mL范圍內(nèi)均可。在優(yōu)化引物濃度時,不僅優(yōu)化了上下游引物濃度比,還優(yōu)化了上下游引物的量。不對稱PCR的產(chǎn)物是ssDNA,因此當引物濃度過高時,易與已形成的ssDNA雜交進行非特異性擴增,所以我們首先優(yōu)化濃度較高的上游引,上游引物濃度從0.2～1μmol/L時,產(chǎn)物量無明顯變化,當上游引物濃度為0.6μmol/L時有少量副產(chǎn)物,為1μmol/L時有大量副產(chǎn)物生成。因此上游引物濃度在0.2～0.4μmol/L范圍內(nèi)均可。以0.4 μmol/L為上游引物濃度,優(yōu)化下游引物濃度時,下游引物濃度從0.0025～0.02 μmol/L時產(chǎn)物量逐漸上升且無副產(chǎn)物,因此選擇下游引物0.02 μmol/L為最佳濃度。結論:乳液不對稱PCR,不需要優(yōu)化循環(huán)數(shù),不會出現(xiàn)常規(guī)不對稱PCR由過度擴增引起的副產(chǎn)物問題,只需通過簡單模板濃度和引物濃度優(yōu)化,就能得到高質(zhì)量的ssDNA文庫。該法能簡單、方便、高效的構建ssDNA文庫,用于適配子的篩選對篩選效率提高有一定的幫助。第二部分乳液單引物PCR構建次級ssDNA文庫方法的建立及優(yōu)化目的:建立并優(yōu)化乳液單引物PCR擴增法構建隨機ssDNA文庫。方法:構建90 bp的隨機寡核苷酸文庫,運用乳液PCR擴增出雙鏈DNA文庫,再以雙鏈DNA文庫為模板,分別用乳液單引物PCR和常規(guī)單引物PCR擴增構建ssDNA文庫,并進行比較。乳液單引物PCR100μl體系含50mmol/L KCl、10mmol/LTris-HCl(pH8.6),2.5mmol/LMgCl2、0.5mmol/LdNTP、0.75μmol/L上游引物、9 pmol/L模板和0.1 U/μL pfu DNA聚合酶。優(yōu)化實驗時,模板濃度從1 pmol/mL到18 pmol/mL,上游引物濃度從0.5到3 μmol/L,DNA聚合酶濃度從 0.075 U/μL 到 0.175 U/μL,dNTP 濃度從 0.25 到 1.25 mmol/L。反應條件為94 ℃變性30 s,然后進入35個循環(huán)94 ℃變性40 s、60 ℃退火30 s、72℃延伸30s,最后延伸3 min。優(yōu)化退火溫度時,溫度從50℃到70℃。優(yōu)化循環(huán)數(shù)從10到35個循環(huán)。結果:乳液PCR可以高質(zhì)量的把ssDNA轉(zhuǎn)化成dsDNA。常規(guī)單引物PCR擴增構建隨機ssDNA文庫,發(fā)現(xiàn)15個循環(huán)時就有明顯副產(chǎn)物出現(xiàn),在20個循環(huán)時目的產(chǎn)物和副產(chǎn)物已經(jīng)融合成涂抹帶,無法分離;乳液單引物PCR在10～35個循環(huán)均無副產(chǎn)物,且產(chǎn)物量明顯高于單引物PCR。作為模板的dsDNA在常規(guī)單引物PCR擴增過程中隨循環(huán)數(shù)的增加逐漸減少,到25個循環(huán)即消失,而乳液單引物PCR的模板量在10～35個擴增循環(huán)中無明顯減少。在優(yōu)化乳液單引物PCR時,首先優(yōu)化模板濃度,當它從18pmol/mL到1pmol/mL時,產(chǎn)物量迅速下降,到1pmol/mL時產(chǎn)物幾乎降到0,模板濃度對產(chǎn)物量影響最大。引物濃度對副產(chǎn)物的影響最大,退火溫度同時影響產(chǎn)物與副產(chǎn)物的量。酶濃度大于0.1 U/μL出現(xiàn)副產(chǎn)物,dNTP濃度對擴增影響相對較小。結論:乳液單引物PCR構建隨機ssDNA文庫同樣不需要優(yōu)化循環(huán)數(shù),無過度擴增產(chǎn)生的副產(chǎn)物。因為乳液單引物PCR模板為ssDNA通過PCR擴增得到dsDNA,模板量足夠,而乳液不對稱PCR所用的模板為篩選過程中直接洗脫的ssDNA,所以乳液單引物PCR在模板量的選擇上更有優(yōu)勢,因此該法也可高效的構建ssDNA文庫。第三部分兩步乳液PCR的建立及在結直腸癌患者p16基因甲基化檢測中的初步應用目的:建立檢測P16基因甲基化的兩步乳液PCR方法,并初步應用在結直腸癌患者血清中P16基因甲基化檢測。方法:分別構建含甲基化和非甲基化P16基因序列的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細菌;建立兩步乳液PCR方法:(1)油包水乳液PCR:用0.1 ml的反應體系(10 mmol/L KCl、20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)、0.2 mmol/L MgSO4、16mmol/L(NH4)2SO4、0.1%TritonX-100、0.5mmol/LdNTP、0.2μmol/L引物、4ul菌液模板和0.1 U/μL pfu DNA聚合酶),制備乳液后分裝100 μl/管,立即進行PCR擴增。反應條件為94 ℃變性5 min,然后進入15個循環(huán)94℃變性30 s、甲基化為69℃ (非甲基化為65℃)退火60s、72℃延伸60s,最后延伸3 min。(2)水包油乳液PCR:油包水乳液PCR擴增結束后,14,000 rpm離心10min,去上層油相,加入33μlPCR反應體系(10mmol/LKCl、20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)、0.2 mmol/L MgSO4、16mmol/L(NH4)2SO4、0.1%TritonX-100、0.5 mmol/L dNTP、0.4 μmol/L 引物和 0.1 U/μL pfu DNA 聚合酶),充分震蕩混勻,制成水包油乳液顆粒,放入PCR儀按上述擴增條件擴增35個循環(huán)。分別應用甲基化特異性PCR和兩步乳液PCR檢測含不同濃度的甲基化和非甲基化P16基因序列的菌液,比較兩種方法的特點。分別檢測36例結直腸癌患者和25健康體檢者血清中p16基因的甲基化情況。結果:靈敏度實驗和干擾實驗結果顯示,兩步法乳液PCR比MSP具有更高的靈敏度和更強的抗干擾能力。兩步法乳液PCR的檢測靈敏度是MSP的10倍。在非甲基化基因的干擾下,兩步法乳液PCR能在甲基化與非甲基化比例為1:100的情況下檢測出甲基化,而MSP只能在甲基化與非甲基化比例為1:10的情況下檢測出甲基化。在檢測結直腸癌患者血清中p16基因的甲基化時,兩步法乳液PCR的檢出率為55.5%,而MSP檢出率只有44.4%。結論:兩步乳液PCR在檢測P16基因甲基化時,表現(xiàn)出較高的靈敏度和抗干擾能力,在臨床檢測實驗中比MSP檢出率更高,可應用于臨床腫瘤的早期診斷。第四部分兩步乳液PCR檢測乙型肝炎病毒核酸方法的建立及初步應用目的:建立兩步乳液PCR檢測乙型肝炎病毒核酸方法,并初步應用于臨床。方法:選取乙型肝炎病毒核酸定量檢測結果500 IU/mL的標本78例,應用熒光定量PCR法檢測并選取無擴增曲線的標本。再分別用普通PCR和用兩步乳液PCR檢測乙肝病毒核酸,并用ELISA檢測乙肝病毒血清標志物。結果:無擴增曲線的40例中,通過兩步乳液PCR有14例(35 %)為陽性,而常規(guī)PCR都為陰性。40例標本中有27例為乙型肝炎病毒表面抗原陽性同時e抗原陰性,即臨床診斷為非活動性乙型肝炎病毒表面抗原陽性攜帶者,而這27例中有10例可通過兩步乳液PCR檢測出乙型肝炎病毒核酸。結論:兩步乳液PCR體系較熒光定量PCR有較高的檢測靈敏度,能進一步檢測定量結果500 IU/mL的病人血清中是否有乙肝病毒,可作為臨床熒光定量PCR的補充檢測手段,為臨床乙肝的診療提供依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R440;R512.62

【參考文獻】

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本文編號：1451379