本文關鍵詞： 球孢白僵菌 septin基因家族 基因敲除 萌發(fā)產(chǎn)孢 多脅迫應答 毒力 轉基因技術 乳清苷5-磷酸脫羧酶基因ura3 營養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip3A ELISA 生防潛能　出處：《浙江大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是重要的昆蟲病原真菌,目前廣泛應用于農(nóng)林害蟲的生物防治。其制劑的有效成份為活體分生孢子,田間殺蟲效果的穩(wěn)定性及持效性受作物環(huán)境或季節(jié)性因素的制約,如環(huán)境溫度、紫外線輻射、化學農(nóng)藥等。因此,研究發(fā)掘球孢白僵菌生長發(fā)育及抗逆性狀的調(diào)控基因服務于菌株的遺傳改良,具有重要的現(xiàn)實意義。同時,通過基因工程技術在提高生防真菌生防潛能的同時盡可能降低環(huán)境安全性風險,是需要探索的重要技術難題。因此,本論文開展了兩方面的研究工作,一是研究解析了球孢白僵菌Septin基因家族的基本生物學功能,二是探索了利用內(nèi)源乳清酸核苷5-磷酸脫羧酶基因ura3作為營養(yǎng)缺陷型安全性標記,在球孢白僵菌中表達昆蟲中腸特異性胃毒蛋白Vip3Aa1而構建低風險工程菌株的可能性。球孢白僵菌Septin基因家族的功能解析Septin是在進化上高度保守的一類GTP結合蛋白,在結構上與Ras GTP激酶家族的成員相似。在球孢白僵菌中存在4個Septin蛋白(BspA/B/C/D),與12種代表性絲狀真菌中對應蛋白的同源性達到79%以上。Septin基因的缺失在不同程度上影響球孢白僵菌的萌發(fā)、生長及分生孢子形成。敲除株的分生孢子萌發(fā)提速,但菌絲細胞隔膜形成滯后且數(shù)量減少,以致生長受到抑制,尤在果糖作為唯一碳源的基礎培養(yǎng)基上表現(xiàn)較嚴重的生長缺陷。在標準培養(yǎng)基上正常培養(yǎng)期間,分生孢子產(chǎn)量在敲除株ΔbspA中下降80～89%,在ΔbspB中下降49～67%,在ΔbspC中下降60～76%,在ΔbspD中下降10～39%。在脅迫應答測定中,敲除株在生長期間對胞壁干擾劑剛果紅的敏感性升高,而對強氧化劑及高滲劑的敏感性則有所降低。其分生孢子耐高溫和紫外輻射能力也有所變化。其中,ΔbspA耐高溫、耐紫外輻射能力均有所下降,ΔbspD僅表現(xiàn)耐紫外輻射的能力下降,而ΔbspB耐高溫能力增強,ΔbspC耐紫外輻射能力提高。但是,敲除株對大蠟螟幼蟲的毒力與野生株和回補株相比未見有實質性的變化。結果表明,4個septin蛋白不僅是球孢白僵菌萌發(fā)生長、細胞分隔、產(chǎn)孢的重要調(diào)控因子,還參與多脅迫應答反應的調(diào)控,但與毒力無顯著關聯(lián)。利用內(nèi)源安全標記基因構建無外源抗性標記的球孢白僵菌工程菌株乳清酸核苷5-磷酸脫羧酶在細胞內(nèi)可催化尿苷(尿嘧啶)的合成,參與基因的翻譯而影響細胞生長。其基因ura3缺失致使細胞自身不能有效合成尿苷或尿嘧啶,因而無法正常生長,但加入外源尿苷即可恢復生長。利用這一特性,以球孢白僵菌ura3作為營養(yǎng)缺陷型標記取代原有的抗除草劑基因草丁膦抗性基因bar,進而構建出表達昆蟲中腸特異性胃毒蛋白Vip3Aa1的一系列工程株BbHUV,經(jīng)PCR、qRT-PCR及ELISA檢測,證明多數(shù)轉化子的菌絲和分生孢子中都有目標殺蟲基因或蛋白的表達,由此建立起無外源風險抗性標記的工程菌構建平臺。
[Abstract]:Beauveria bassiana (Beauveria bassiana) is an important entomopathogenic fungus, which is widely used in the biological control of agricultural and forestry pests. The stability and efficacy of field insecticidal effects are restricted by crop environment or seasonal factors, such as ambient temperature, ultraviolet radiation, chemical pesticides and so on. It is of great practical significance to explore the regulatory genes of Beauveria bassiana growth and resistance to stress for the genetic improvement of the strain. It is an important technical problem to improve the biocontrol potential of fungi and reduce the risk of environmental safety by genetic engineering. Therefore, two aspects of research work have been carried out in this paper. First, the basic biological functions of Septin gene family of Beauveria bassiana were analyzed. The second is to explore the use of endogenous nucleoside 5-phosphate decarboxylase gene ura3 as a nutritional deficiency safety marker. It is possible to construct a low-risk engineering strain by expressing insect midgut specific gastrotoxic protein Vip3Aa1 in Beauveria bassiana. The functional analysis of the Septin gene family of Beauveria bassiana is expressed in the gene family of Beauveria bassiana. A highly conserved class of GTP binding proteins. The structure is similar to that of Ras GTP kinase family. There are four Septin proteins BspA / B / C / D in Beauveria bassiana. The homology of the corresponding protein with 12 representative filamentous fungi was above 79%. The deletion of Septin gene affected the germination of Beauveria bassiana to varying degrees. Growth and conidial formation. The conidial germination of knockout strain increased, but the formation of hyphal cell membrane was delayed and the number decreased, resulting in the inhibition of growth. Especially in the basal medium with fructose as the sole carbon source, the growth defects were more serious. During the normal culture on the standard medium, the conidial yield decreased by 80% to 89% in the knockout plant 螖 bspA. The contents of 螖 bspB, 螖 bspC, 螖 bspD and 螖 bspD were decreased by 49%, 60% and 1039%, respectively. The sensitivity of the knockout strain to the cell wall interferential agent Congo red increased, but to the strong oxidant and hyperosmotic agent decreased, and its conidial resistance to high temperature and ultraviolet radiation also changed. The ability of 螖 bspA to resist high temperature and ultraviolet radiation were all decreased. 螖 bspD only showed the ability of ultraviolet radiation resistance decreased, while 螖 bspB's ability to resist high temperature increased. The ability of 螖 bspC to resist ultraviolet radiation was improved. However, the virulence of knockout plant to larva was not significantly different from that of wild plant and compensatory plant. The results showed that there was no significant change in the virulence of the knockout plant. The four septin proteins were not only important regulatory factors for germination and growth of Beauveria bassiana, but also involved in the regulation of response to multiple stress. However, there was no significant correlation with virulence. The nucleoside 5-phosphate decarboxylase of whey nucleoside 5-phosphate could catalyze the synthesis of uridine (uracil) in cells. Participate in the translation of genes and affect cell growth. The deletion of the gene ura3 makes the cells can not effectively synthesize uridine or uracil, so they can not grow normally. However, exogenous uridine could restore growth. By using this characteristic, the herbicide resistant gene bar was replaced by ura3 as a nutritional deficiency marker. Then a series of engineering strain BbHUVexpressing insect midgut specific gastrotoxic protein Vip3Aa1 were constructed and detected by PCR qRT-PCR and ELISA. It was proved that the target insecticidal gene or protein was expressed in the hyphae and conidium of most transformants, and the construction platform of engineering bacteria without exogenous risk resistance markers was established.
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S476

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本文編號：1451154