本文關(guān)鍵詞： 慢性乙型肝炎 肝細(xì)胞LO2 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的含SH2結(jié)構(gòu)域蛋白 炎癥因子 STAT5a　出處：《成都醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的通過基因干預(yù)手段調(diào)節(jié)肝細(xì)胞LO2中CISH的表達(dá),探討CISH對(duì)肝細(xì)胞LO2炎性因子表達(dá)的調(diào)控及可能機(jī)制。方法1、構(gòu)建CISH重組過表達(dá)質(zhì)粒并上調(diào)肝細(xì)胞LO2中CISH的表達(dá)模板CISH質(zhì)粒購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司;設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增CISH目的片段;采用Xho I/Kpn I酶切法,將目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和空質(zhì)粒GV230重組構(gòu)成CISH重組過表達(dá)質(zhì)粒;用構(gòu)建好的CISH重組過表達(dá)質(zhì)粒借助lipo 2000轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞LO2;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法Western Blot分別檢測(cè)肝細(xì)胞LO2中CISH在m RNA和蛋白水平的變化。2、合成CISH si RNA并下調(diào)肝細(xì)胞LO2中CISH的表達(dá)CISH si RNA(#1、#2、#3)三條序列購(gòu)于廣州銳博生物技術(shù)有限公司,將CISH si RNA(#1、#2、#3)借助lipo 2000轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞LO2;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法Western Blot分別檢測(cè)肝細(xì)胞LO2中CISH在m RNA和蛋白水平的變化。3、檢測(cè)CISH表達(dá)變化對(duì)肝細(xì)胞LO2炎癥因子表達(dá)的影響CISH重組過表達(dá)質(zhì)粒和CISH si RNA轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞LO2 48h后,利用ELISA法檢測(cè)LO2肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量。4、檢測(cè)CISH表達(dá)變化后,肝細(xì)胞LO2中信號(hào)分子STAT5a的變化CISH重組過表達(dá)質(zhì)粒和CISH si RNA轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞LO2 48h后,蛋白質(zhì)印跡法Western Blot檢測(cè)肝細(xì)胞LO2中信號(hào)分子STAT5a的表達(dá)變化。結(jié)果1、成功構(gòu)建CISH重組過表達(dá)質(zhì)粒CISH重組過表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR鑒定及序列測(cè)定證實(shí),擴(kuò)增出的CISH基因片段與基因數(shù)據(jù)庫中的序列一致,轉(zhuǎn)染人正常肝細(xì)胞LO2中能夠表達(dá),表明CISH重組過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。2、成功構(gòu)建CISH上、下調(diào)肝細(xì)胞模型實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法Western Blot檢測(cè)表明,與陰性對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染CISH重組過表達(dá)質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組1可上調(diào)CISH的表達(dá),而轉(zhuǎn)染CISH si RNA的實(shí)驗(yàn)組2可下調(diào)CISH的表達(dá),這表明我們成功構(gòu)建了CISH上、下調(diào)的肝細(xì)胞模型。3、CISH表達(dá)改變后影響肝細(xì)胞LO2分泌炎癥因子TNF-α和IL-1βELISA法檢測(cè)表明,與陰性對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染CISH重組過表達(dá)質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組1中的肝細(xì)胞LO2細(xì)胞分泌的炎癥因子TNF-α和IL-1β水平表現(xiàn)出降低趨勢(shì),而轉(zhuǎn)染CISH si RNA的實(shí)驗(yàn)組2中的肝細(xì)胞LO2細(xì)胞分泌的炎癥因子TNF-α和IL-1β水平則表現(xiàn)出升高趨勢(shì)。4、CISH上、下調(diào)后肝細(xì)胞LO2中信號(hào)分子STAT5a的表達(dá)發(fā)生改變蛋白質(zhì)印跡法Western Blot檢測(cè)表明,與陰性對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染CISH重組過表達(dá)質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組1中的信號(hào)分子STAT5a表達(dá)量降低,而轉(zhuǎn)染CISH si RNA的實(shí)驗(yàn)組2中的信號(hào)分子STAT5a表達(dá)量則升高。結(jié)論1、CISH基因負(fù)性調(diào)控肝細(xì)胞LO2中炎癥因子TNF-α和IL-1β的分泌;2、CISH基因可能通過抑制其下游信號(hào)分子STAT5a的表達(dá)從而影響肝細(xì)胞LO2炎癥因子的分泌。
[Abstract]:Objective to investigate the regulation and possible mechanism of CISH on the expression of LO2 inflammatory factors in hepatocytes by regulating the expression of CISH in hepatocytes by gene intervention. Methods 1. Construction of CISH recombinant expression plasmid and up-regulation of CISH expression template CISH plasmid in hepatocyte LO2 were purchased from Shanghai Kikai Gene Technology Co., Ltd. Primers were designed to amplify the CISH fragment. Using Xho I / KpnI digestion method, the target gene PCR amplification product and empty plasmid GV230 were recombined to form CISH overexpression plasmid. The recombinant CISH expression plasmid was transfected into liver cell line LO2 with the aid of lipo 2000. Real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot Western Blot were used to detect the changes of CISH and protein levels in LO2 of hepatocytes, respectively. To synthesize CISH si RNA and down-regulate the expression of CISH in LO2 of hepatocytes, three sequences of CISH si RNAs #1, #2 and #3) were purchased from Guangzhou Ruibo Biotechnology Co., Ltd. CISH si RNAs #1, #2 and #3 were transfected into liver cell line LO2 with the aid of lipo 2000. Real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot Western Blot were used to detect the changes of CISH and protein levels in LO2 of hepatocytes. Effects of CISH expression on the expression of LO2 inflammatory Factor in Hepatocytes; the expression of CISH recombinant plasmids and CISH si RNA were transfected into hepatocytes LO2 48 h after transfection. The content of inflammatory factor TNF- 偽 and IL-1 尾 in the supernatant of LO2 hepatocyte culture was detected by ELISA method, and the expression of CISH was detected. Changes of signal molecule STAT5a in LO2 of Hepatocytes CISH recombinant expression plasmid and CISH si RNA were transfected into LO2 for 48 h. Western blot Western Blot was used to detect the expression of signal molecule STAT5a in hepatocyte LO2. Results 1. CISH recombinant overexpression plasmid CISH was successfully constructed and confirmed by colony PCR identification and sequence analysis. The amplified CISH gene fragment was consistent with the sequence in gene database. The expression of LO2 in human normal hepatocytes showed that the recombinant plasmid of CISH was constructed successfully and the CISH was constructed successfully. The down-regulation of hepatocyte model was detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot Western Blot. Experimental group 1 transfected with recombinant expression plasmid of CISH could up-regulate the expression of CISH, while group 2 transfected with CISH si RNA could down-regulate the expression of CISH. This indicates that we successfully constructed a down-regulated hepatocyte model of CISH. 3. TNF- 偽 and IL-1 尾 ELISA were detected after the change of CISH expression, which affected the secretion of LO2 in hepatocytes, compared with the negative control group. The levels of inflammatory cytokines TNF- 偽 and IL-1 尾 secreted by LO2 cells in experimental group 1 transfected with recombinant expression plasmid of CISH showed a decreasing trend. However, the levels of inflammatory cytokines TNF- 偽 and IL-1 尾 secreted by hepatocyte LO2 cells in experimental group 2 transfected with CISH si RNA showed an increasing trend. The expression of signal molecule STAT5a in hepatocyte LO2 was down-regulated. The result of Western Blot detection by Western blot showed that compared with the negative control group. The signal molecule STAT5a expression in experimental group 1 transfected with recombinant CISH expression plasmid was decreased. However, the expression of signal molecule STAT5a in experimental group 2 transfected with CISH si RNA was increased. Conclusion 1. CISH gene negatively regulates the secretion of inflammatory cytokines TNF- 偽 and IL-1 尾 in LO2 of hepatocytes. 2 the CISH gene may affect the secretion of LO2 inflammatory factors by inhibiting the expression of its downstream signal molecule STAT5a.
【學(xué)位授予單位】：成都醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R512.62

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本文編號(hào)：1446929