本文關(guān)鍵詞： 木聚糖酶 分離純化 酶學(xué)性質(zhì) 畢赤酵母 可溶性表達(dá)　出處：《廣西大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：木聚糖酶是一類降解木聚糖分子中β-1,4-木糖苷鍵的酶系,主要包括內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶以內(nèi)切方式作用于木聚糖主鏈內(nèi)部的β-1,4-木糖苷鍵,其主要水解產(chǎn)物為低聚木糖和少量木糖。不同來源木聚糖酶酶學(xué)特性存在明顯的差異,其水解產(chǎn)物的特性也不完全相同,可廣泛用于再生能源、啤酒釀造、飼料、食品、造紙等工業(yè)。本課題從實(shí)驗(yàn)室已篩選鑒定的一株產(chǎn)木聚糖酶的纖維微菌屬(Cellulosimicrobium sp.XM-8)菌株出發(fā),通過逐步的分離純化其野生酶,最終得到一條具有木聚糖酶活性的蛋白條帶命名為Xyn-8,并對該野生酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析測定。結(jié)果表明該野生酶的最適溫度60℃,最適pH值為5.0,其擁有良好的溫度穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性;在50℃及以下溫度條件中處理8h后仍剩余70%以上的酶活力,在pH4-10之間處理12 h后仍具有80%以上的酶活力;該酶具有很強(qiáng)的底物特異性,只對木聚糖底物有酶活力;5mM的Na~+、Mg~（2+）和Ba~（2+）對酶活性有輕微的激活作用,Ag~+、Hg~（2+）及化學(xué)試劑SDS對其有強(qiáng)烈的抑制作用,使其酶活幾乎完全喪失。在最適條件下,測定可溶性底物Beechwood木聚糖的K_m和V_（max）為2.167±0.18 g/L,740.6±15.77μmol/min·mg~（-1）,以蔗渣木聚糖為不可溶性底物時(shí)K_m和V_（max）分別為7.91±0.56 g/L和806.8±21.34μmol/min·mg~（-1）。通過序列對比后設(shè)計(jì)簡并引物克隆得到該木聚糖酶完整基因,該基因存在一個(gè)10家族的催化功能與和兩個(gè)碳水化合物結(jié)合域,通過利用大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)大量的目的蛋白以不可溶性的包涵體形式存在。結(jié)構(gòu)域的分析表明該酶包含一個(gè)10家族的催化功能域與和兩個(gè)碳水化合物結(jié)合域,為了獲得大量可溶性表達(dá)以及探索碳水化合物結(jié)合域?qū)岱�(wěn)定性及其它酶學(xué)性質(zhì)的影響,本實(shí)驗(yàn)將已克隆的完整基因Xyn-8a和去除碳水化合物結(jié)合域的基因Xyn-8c連接pPIC9K載體導(dǎo)入畢赤酵母GS115細(xì)胞中進(jìn)行高密度發(fā)酵表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Xyn-8a和Xyn-8c在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中獲得了良好的可溶性表達(dá)�；騒yn-8c Pastoris GS115中表達(dá)時(shí)比在大腸桿菌中表達(dá),熱穩(wěn)定性有很大的提高,最適溫度提高了10℃,溫度穩(wěn)定性由45℃處理0.5 h后殘留50%酶活力,提高至55℃處理8 h仍有接近40%的酶活力。結(jié)果表明重組酶與底物的親和力減小,而去除碳水化合物的重組酶最適溫度及熱穩(wěn)定性有了很大的提高,推測可能是由于酵母表達(dá)系統(tǒng)中密碼子親和性以及進(jìn)行的N-糖基化結(jié)構(gòu)修飾不同于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),因此對酶學(xué)性質(zhì)造成了影響。
[Abstract]:Xylanase (Xylanase) is a kind of enzyme system that degrades 尾 -1N 4-xylonoside bond in xylan molecule, mainly including 尾 -1N 4-xylanase and 尾 -xylosidase. Endoglycosidase. 4xylanase endonuclease digestion acts on the 尾 -1m4-xyloside bond in the main chain of xylan. The main hydrolytic products were xylooligosaccharides and a small amount of xylose. The enzymatic properties of xylanase from different sources were obviously different, and the characteristics of the hydrolysates were not completely the same, which could be widely used in renewable energy and beer brewing. Feed, food. In papermaking and other industries, a strain of Cellulosimicrobium sp.XM-8, which has been screened and identified in the laboratory, is used to produce xylanase. A protein band with xylanase activity was obtained by gradual isolation and purification of its wild enzyme, which was named Xyn-8. The results showed that the optimum temperature and pH value of the wild enzyme were 60 鈩，

本文編號：1445201