本文關(guān)鍵詞： 豬流行性腹瀉病毒 感染性cDNA克隆 病毒拯救 S基因 突變 增殖 致病性　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以急性腸炎、腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病。各年齡段豬對(duì)該病均易感,其中哺乳仔豬的發(fā)病率和死亡率最高,可達(dá)100%。2010年以來,我國出現(xiàn)以S基因變異為主要特征的高毒力PEDV變異毒株并廣泛流行,引起PED疫情的暴發(fā),給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,開展PEDV的致病機(jī)制研究對(duì)于PED的防控具有重要的科學(xué)意義。本研究以PEDV分離毒株為研究對(duì)象,構(gòu)建PEDV反向遺傳操作技術(shù)平臺(tái),并進(jìn)一步分析S基因突變對(duì)PEDV的增殖和致病性的影響,以期為闡明PEDV的分子致病機(jī)制奠定必要的技術(shù)基礎(chǔ)。從北京地區(qū)發(fā)生仔豬腹瀉的豬場(chǎng)臨床病料中分離到1株P(guān)EDV,命名為CHM2013。CHM2013具有良好的細(xì)胞適應(yīng)性,可以在Vero細(xì)胞上穩(wěn)定傳代,其增殖無需在培養(yǎng)基中添加胰酶。根據(jù)GenBank中收錄的PEDV基因組序列設(shè)計(jì)引物,采用RT-PCR的方法擴(kuò)增PEDV CHM2013基因組片段,并進(jìn)行全基因組序列測(cè)定。結(jié)果顯示,排除poly(A)尾,CHM2013的全基因組大小為27994 nt。選取26株分屬不同亞群具有代表性的PEDV毒株的全基因組序列與CHM2013進(jìn)行比較并繪制進(jìn)化樹。結(jié)果表明,CHM2013屬于PEDV的GⅠ亞群,與經(jīng)典毒株CV777、SM98、DR13屬同一亞群,全基因組同源性為97.9%-99.9%;與GⅡ亞群的參考毒株相比,同源性為96.5%-96.8%,而與重組毒株的同源性為97.0%-97.1%�；赑EDV毒株CHM2013和實(shí)驗(yàn)室分離的強(qiáng)毒株BJ-2011-C的全基因組序列設(shè)計(jì)引物,分段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,并通過同義突變引入酶切位點(diǎn),將CHM2013及BJ-2011-C的全長cDNA連入低拷貝質(zhì)粒pBeloBAC11,同時(shí)插入巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV)、丁型肝炎核酶序列(HDV-RZ)、牛生長激素序列(BGH)等元件,獲得PEDV CHM2013和BJ-2011-C的全長cDNA克隆質(zhì)粒pBAC-CHM2013和pBAC-B J-2011-C。采用點(diǎn)突變方法對(duì)CHM2013基因組的1809位堿基(T-→C)、BJ-2011-C基因組的15932位堿基(G→A)進(jìn)行突變,引入遺傳標(biāo)記以區(qū)分拯救病毒與親本病毒。將全長cDNA克隆質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染Vero-CCB81細(xì)胞,觀察細(xì)胞病變并鑒定拯救病毒。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染的Vero-CCB81細(xì)胞能產(chǎn)生與親本病毒感染相同的細(xì)胞病變;提取P3代拯救病毒基因組進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)及序列測(cè)定,可以檢測(cè)到遺傳標(biāo)記的存在;用PEDV N蛋白單抗4E3進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn),可見拯救病毒感染細(xì)胞呈現(xiàn)特異性熒光染色。拯救的克隆病毒分別命名為rCHM2013和rBJ-2011-C。由此表明,構(gòu)建的PEDV毒株CHM2013和BJ-2011-C的全長cDNA克隆具有感染性,可成功拯救出病毒。分析了拯救病毒的體外增殖特性和對(duì)哺乳仔豬的致病性。多步生長曲線試驗(yàn)結(jié)果表明,rCHM2013和rBJ-2011-C在Vero-CCL81細(xì)胞上具有與其親本病毒相似的培養(yǎng)特性和增殖動(dòng)態(tài)。動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示,rBJ-2011-C呈現(xiàn)高毒力,接種的2日齡哺乳仔豬出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉,死亡率為100%(4/4);而rCHM2013接種仔豬全部存活,未見腹瀉的臨床癥狀,表明PEDVCHM2013是弱毒株。利用弱毒株CHM2013的感染性cDNA克隆,依據(jù)PEDV強(qiáng)毒株S基因變異的特點(diǎn),選擇其中五個(gè)變異較大的區(qū)域(aa27-29QST→SAN;aa56-58MNS→GENQGVN氨基酸插入及突變;aa68-72 GTGIE→AGQHP;aa84-89 YIDSSQ→HIRGGH;aa158-163 RDGKDI→SEHS氨基酸缺失及突變),構(gòu)建出以CHM2013為骨架單獨(dú)置換各個(gè)區(qū)域的cDNA克隆質(zhì)粒,并進(jìn)行病毒拯救。結(jié)果顯示,R-C-GENQGVN和R-C-SEHS兩個(gè)重組cDNA克隆具有感染性,可拯救出病毒;而其余三個(gè)重組cDNA克隆無感染性,不能拯救出病毒。我們進(jìn)一步構(gòu)建了同時(shí)置換GENQGVN和SEHS兩個(gè)區(qū)域的重組克隆R-C-GENQGVN+SEHS,并拯救出重組病毒。對(duì)拯救的重組病毒增殖動(dòng)態(tài)分析結(jié)果表明,拯救出的三個(gè)突變體重組病毒在Vero細(xì)胞上的增殖動(dòng)態(tài)與rCHM2013相似。致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示,R-C-GENQGVN+SEHS對(duì)仔豬無明顯的致病性,接種仔豬無腹瀉臨床癥狀,表明依據(jù)PEDV強(qiáng)毒株S基因的變異特點(diǎn),進(jìn)行弱毒株CHM2013的S基因插入及缺失突變,不會(huì)導(dǎo)致弱毒株致病性增強(qiáng)。綜上所述,我們成功構(gòu)建了 PEDV弱毒株CHM2013和強(qiáng)毒株BJ-2011-C的感染性cDNA克隆,并初步分析了 PEDV強(qiáng)毒株S基因插入及缺失對(duì)弱毒株CHM2013復(fù)制能力和致病性的影響。結(jié)果表明,構(gòu)建的PEDV弱毒株和強(qiáng)毒株的cDNA克隆具有感染性,可拯救出病毒;PEDV強(qiáng)毒株S蛋白標(biāo)志性的氨基酸插入及缺失不影響弱毒株的體外增殖能力和致病性,為進(jìn)一步深入研究PEDV的分子致病機(jī)制奠定了必要的反向遺傳操作技術(shù)平臺(tái)。
[Abstract]:A high virulent PEDV strain named CHM2013.CHM2013 was amplified by RT - PCR . The results showed that the whole genome sequence of PEDV was 97.0 % - 97.1 % . The results showed that the recombinant cDNA clone of CHM2013 and BJ - 2011 - C was infected with the virus . The results showed that the recombinant clones of CHM2013 and rBJ - 2011 - C were infected with the same virus . The results showed that the recombinant clones of CHM2013 and BJ - 2011 - C were infected with the virus . In order to further study the molecular pathogenesis of PEDV , the necessary reverse genetic manipulation technology platform is laid .

【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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1 程慶華;牛小迎;葉成玉;;青海地區(qū)豬流行性腹瀉病調(diào)查[J];青海畜牧獸醫(yī)雜志;1992年03期

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1 孫瑞芹;華南地區(qū)豬流行性腹瀉病毒的分子流行病學(xué)與病原學(xué)研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：1444011