本文關(guān)鍵詞：斑馬魚基因工程的研究進展，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

　遺傳學(xué)報　ActaGeneticaSinica,October2004,31(10):1167～1174ISSN0379-4172

TheResearchProgressofZebrafishGeneEngineering

WUYu-Ping,XIONGQian,ZHANGGuang-Xian,XUAn-Long

(TheOpenLaboratoryofMarineFunctionalGenomicsofStateHigh-TechDevelopment,

CollegeofLifeSciences,SunYat-senUniversity,Guangzhou510275,China)

Abstract:Theresearchprogressofzebrafishgeneengineeringisreviewed,inincludingtherecentexplosionstatusoftransgeniczebrafishlines,transgeneiczebrafishintargetedscreens,thedevelopmentoftransgenictechnologyinze-brafishaswellasthecurrenthotspotsandfutureperspectiveofzebrafishgeneengineering.Bynowthezebrafishgeneengineering,nucleartransplantationandchromosomesetmanipulationtechnologieshavebeenestablishedinChina.Withfirmfoundationofzebrafishcytogeneticsandembryology,wewillobtaingeneengineeringzebrafishwithgenetar-getingintegrationandpromotetheadvancementanddevelopmentofbiotechnologyinappliedresearchfieldinnearfu-ture.

Keywords:zebrafish;geneengineering

斑馬魚基因工程的研究進展

吳玉萍,熊　茜,張廣獻,徐安龍

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,國家“863”計劃海洋生物功能基因組開放實驗室,廣州　510275)

摘　要:對國內(nèi)外斑馬魚基因工程研究進展,包括最近獲得的大批轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系、靶向篩選的轉(zhuǎn)基因斑馬魚、斑馬魚轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展和斑馬魚基因工程的熱點問題與應(yīng)用前景進行了綜述。指出我國已建立日趨成熟的斑馬魚轉(zhuǎn)基因技術(shù)、細胞核移植技術(shù)和染色體組操作技術(shù),具有斑馬魚細胞遺傳學(xué)和胚胎學(xué)基礎(chǔ),我國有望在不久的將來獲得定向整合的基因工程斑馬魚,并推動生物技術(shù)應(yīng)用研究領(lǐng)域的進步和發(fā)展。關(guān)鍵詞:斑馬魚;基因工程

中圖分類號:Q341　　　文獻標識碼:A　　　文章編號:0379-4172(2004)10-1167-08

　　20世紀90年代開始啟動的“人類基因組計劃”(HGP)重點內(nèi)容之一是對模式生物的研究。具備脊椎動物分子發(fā)育生物學(xué)和人類基因組計劃模式種條件的斑馬魚,由于其易于進行細胞譜系分析并兼具酵母、線蟲、果蠅和小鼠式遺傳的特征而日益受到學(xué)者的關(guān)注。1981年,Streisinger[1]在《Nature》上發(fā)

表了關(guān)于斑馬魚克隆系的研究,隨后它的基因連鎖圖的構(gòu)建成為突變基因克隆的開端[2]。

1　斑馬魚基因工程研究概況

斑馬魚的轉(zhuǎn)基因研究始于1988年[3,4],此后進

收稿日期:2003-10-17;修回日期:2004-02-13

基金項目:國家“863”計劃項目(編號:2002AA629010)、國家自然科學(xué)基金(編號:30371113)、廣東省科技計劃項目(編號:2003C20303)和珠海

市科技計劃項目(編號:PC200310043)資助[SupportedbytheNational“863”Project(No.2002AA629010),ChineseNationalNaturalScienceFoundation(No.30371113),theScienceandTechnologyProjectofGuangdongProvince(No.2003C20303)andtheScienceandTechnologyProjectofZhuhaiCity(No.PC200310043)]

作者簡介:吳玉萍(1963-),女,博士,副教授,研究方向:魚類遺傳學(xué)。E-mail:exwyp@zsu.edu.cn

1168遺傳學(xué)報　ActaGeneticaSinica　Vol.31　No.10　2004

展迅速。目前,國內(nèi)外已獲得大批轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系(表1)。例如:1992年,Lin等[5]把有色斑馬魚囊胚細胞注入白化種囊胚,得到有色素細胞的嵌合體,嵌合體與白化魚交配得到有色后代;移植轉(zhuǎn)lacZ基

因囊胚細胞也得到嵌合體,轉(zhuǎn)基因性狀可以傳遞給后代。斑馬魚轉(zhuǎn)基因技術(shù)對分析體內(nèi)細胞間相互作

用,作為動物模型探討發(fā)育、生長、繁殖等機理,以及闡明控制脊椎動物的發(fā)育機制等方面均具有重要意義。目前,斑馬魚卵母細胞體外成熟、配子發(fā)生和受精的調(diào)控機制、胚胎干細胞的分離、基因克隆及基因敲除等研究都已成為研究熱點。

表1　轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系

Table1　Transgeniczebrafishlines

表達分類Expressioncategory1無限制Unrestricted

pUSVCATRSV/lacZCMV/luciferasedHSP/CAT-NPT-BGALdHSP/HPTXenopusef1a/lacZ

PPPPP

pSV/hygro

轉(zhuǎn)植基因Transgene

載體VectorP

表達模式Expressionpattern無表達Notexpressed一批陽性

Batchassaypositive無表達

Notexpressed無表達Notexpressed無表達Notexpressed

5個種系自普遍存在至斑駁的表達

Fivelinesrangefromubiquitoustopatch

MoMLV/lacZRSV/neoXenopusef1a/GFP

RP

無表達Notexpressed2/4可檢測表達,普遍存在2/4withdetectableexpression,ubiquitous

Carpβactin/CAT

P

不均一表達,限制于軸向和軸旁的中胚層

Nonuniformexpressionlimitedtoaxialandparaxialmesoderm

Xenopusef1a/lacZZebrafishβactin/GFPXenopusef1a/GFPCarpβactin/CATCarpβactin/CATXenopusef1a/GFPntdMedakaβactin/GFPZebrafishef1a/H2BGFP

RPTPP+IPP+ITRP

無表達Notexpressed普遍存在Ubiquitous普遍存在Ubiquitous普遍存在Ubiquitous普遍存在Ubiquitous普遍存在Ubiquitous普遍存在Ubiquitous普遍存在(定位細胞核)Ubiquitous(nuclearlocaliza-tion)

2神經(jīng)系統(tǒng)Nervoussystem

Zebrafishislet1/GFPZebrafishHuC/GFP

PP

MouseHSP/lacZ

P

7/8非表達系,1個種系表達7/8nonexpressinglines;1lineexpressing頭蓋運動神經(jīng)元Cranialmotorneurons神經(jīng)系統(tǒng)Nervoussystem

32＊6

[20]

88241219100

＊

轉(zhuǎn)基因發(fā)生率(%)

Rateoftransgenesis

5＊7163316

參考文獻Reference[3][4][6][7][8][9]

167

[10][11]

7

[12]

83

[13][14][15][16][16][17][18][19]

[21][22]

WUYu-Pingetal.:TheResearchProgressofZebrafishGeneEngineering1169續(xù)表1

表達分類Expressioncategory

轉(zhuǎn)植基因Transgene

Goldfisha1tubulin/GFPZebrafishrodopsin/GFPRatGAP43/GFPZebrafishHuC/GFPZebrafishpax2.1/lacZ

載體VectorPPPPP

表達模式Expressionpattern神經(jīng)系統(tǒng)Nervoussystem視網(wǎng)膜桿狀體光感受器Rodphotoreceptors神經(jīng)系統(tǒng)Nervoussystem神經(jīng)系統(tǒng)

Nervoussystem

MHB,后腦,脊髓等

MHB,hindbrain,spinalcordetal.

轉(zhuǎn)基因發(fā)生率(%)

Rateoftransgenesis2～54＊31009

參考文獻Reference[23][24][25][19][26]

ZebrafishAANAT-2/GFP

3淋巴細胞Lymphoidcell

Zebrafishrag1/GFP

PPAC

松果腺光感受器Pinealphotoreceptor

容量最大載體,在胸腺腎、嗅覺神經(jīng)元中表達

Largestconstructexpressedinthymus,kidneyandolfactoryneurons

3n.a.

[27][28]

4上皮細胞Epithelia5胰腺Pancreas6肌肉Muscle

Zebrafishkrt8/GFPZebrafishinsulin/GFPZebrafisha-actin/GFPZebrafisha-actin/GFP

PPP+ITRPP+/-NLS

上皮細胞Epithelia胰腺Pancreas肌肉Muscle

肌肉Muscle

中間細胞和循環(huán)血液Intermediatecellmassandcir-culatingblood

16n.a.6281

[29][30][18][14][31]

7血液Blood8生殖細胞Germcells9脈管系統(tǒng)Vasculature

Zebrafishgata1/GFP

Zebrafishvasa/GFPZebrafishfli1/GFP

PP

生殖細胞Germcells

脈管系統(tǒng)、主動脈弓、頜、鰭間葉細胞

Developingvasculature,aorticarches,jaw,finmesenchyme

215

[32][33]

10熱激-誘導(dǎo)型Heatshock-inducible

Zebrafishhsp70/GFPZebrafishhsp/slit2-GFP

PP

熱激普遍存在

Ubiquitousuponheatshock熱激普遍存在

Ubiquitousuponheatshock

24

[34][35]

　　P:質(zhì)粒;P+I:具絕緣子的質(zhì)粒;P+NLS:質(zhì)粒和核定位序列多肽;T:轉(zhuǎn)座子;R:逆轉(zhuǎn)錄病毒;P+ITR:具反向末端重復(fù)的腺相關(guān)病毒的質(zhì)粒;PAC:P1人工染色體;＊:基于單個轉(zhuǎn)基因動物;n.a.:信息無效;lacZ:β-半乳糖苷酶基因;CMV:巨細胞病毒;CAT:氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶;HSP:熱激啟動子;GFP:綠色熒光蛋白;NPT:新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶;BGAL:β-半乳糖苷酶;HPT:潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶;MoMLV:莫洛尼氏剛果紅白血病毒。

P:plasmid;P+I:plasmidwithinsulatorelements;P+NLS:plasmid+nuclearlocalizationsequencepeptides;T:transposon;R:retrovirus;P+ITR:plasmidwithadeno-assoicatedvirusinvertedterminalrepeat;PAC:P1artificialchromosome;＊:basedonsingletransgenicanimal;n.a.:infor-mationnotavailable;lacZ:β-galactosidasegene;CMV:cytomegalovirus;CAT:chloramphenicolacetyltransferase;HSP:heatshockpromoter;GFP:greenfluorescentprotein;NPT:neomycinphosphotransferase;BGAL:β-galacosidase;HPT:hygromycinphospho-transferase;MoMLV:MoloneyMurineLeukemiaVirus.

　　1982年,Palmiter[36]等將大鼠生長激素基因轉(zhuǎn),“鼠”,這一突破性成果為動物基因工程定向育種研究,

1170遺傳學(xué)報　ActaGeneticaSinica　Vol.31　No.10　2004

生物研究所朱作言領(lǐng)導(dǎo)的實驗室在世界上率先開展了魚類基因工程定向育種研究,建立了完整的轉(zhuǎn)基因魚理論模型和完善的實驗技術(shù)體系,為轉(zhuǎn)基因魚育種奠定了理論基礎(chǔ)。目前,全世界有數(shù)十個

實驗室開展了魚類基因轉(zhuǎn)移研究,建立了顯微注射、電融合及精子攜帶法等多種基因轉(zhuǎn)移方法,獲得了快速生長的轉(zhuǎn)基因鯉、大馬哈魚、虹鱒、大西洋鮭和羅非魚等,規(guī)�；B(yǎng)殖實驗也在進行中。雖然基因工程定向育種技術(shù)已取得突破,但基因工程育種的目的還未能達到,外源基因的隨機整合、非可控表達及轉(zhuǎn)基因魚生物安全性等問題,嚴重影響了這一基因工程育種技術(shù)在魚類育種上的有效應(yīng)用,成為制約轉(zhuǎn)基因魚研究進一步發(fā)展和推廣應(yīng)用的瓶頸。因此,開辟一條基因工程育種新途徑的研究顯得十分迫切和必要。利用同源重組進行內(nèi)源基因修飾與可控表達及基因修飾魚克隆技術(shù)的建立,對魚類基因工程育種、生物反應(yīng)器研制以及基因功能與表達調(diào)控和發(fā)育生物學(xué)研究,都具有重大理論指導(dǎo)意義和潛在應(yīng)用價值。由于斑馬魚為模式魚,其遺傳背景清楚、繁殖周期短、產(chǎn)卵過程可人為控制、懷卵量大、體外受精、胚胎透明便于觀察等,并已具有成熟的轉(zhuǎn)基因技術(shù),因而已成為魚類基因工程中基因同源重組、基因表達調(diào)控和基因功能研究的理想材料。

魚類克隆研究始于1963年,是由我國學(xué)者童第周教授等率先進行的。20世紀70年代,中國科學(xué)院水生生物研究所參與合作,克隆了第一尾鯉鯽囊胚細胞核移植魚。隨后在80年代,中國科學(xué)院水生生物研究所將魚類細胞培養(yǎng)與細胞核移植相結(jié)合,獲得第一例體細胞克隆脊椎動物,即腎細胞核移植鯽魚。轉(zhuǎn)基因克隆魚的研究,就是把基因轉(zhuǎn)移和克隆技術(shù)結(jié)合起來,應(yīng)用于魚類,建立一套快速省時的魚類基因工程方法,為培育魚類新品種和建立生物反應(yīng)器提供技術(shù)儲備。該項研究可以縮短培育純系轉(zhuǎn)基因魚的時間,提高目的基因整合率,具有廣泛的應(yīng)用前景。目前,模式動物斑馬魚的細胞核移植研究已在國內(nèi)外實驗室獲得成功,鑒于斑馬魚的類胚胎干細胞研究已取得進展,它將為斑馬魚基因組定向整合技術(shù)奠定基礎(chǔ),并有望在研究脊椎動物發(fā)育過程的基因功能、細胞核發(fā)育潛能及核質(zhì)關(guān)系等理論問題上發(fā)揮重要作用。

[39～41]

[37,38]

2　斑馬魚基因工程發(fā)展前景

2.1　靶向篩選的轉(zhuǎn)基因魚類

過去大部分的研究集中在利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚進行發(fā)育基因表達和活體形態(tài)發(fā)生等方面,今后須考慮利用熒光標記魚來篩查突變體、小分子或抑制正常發(fā)育的毒素�；驘晒鈽擞涺~類與反求遺傳學(xué)方法聯(lián)合起來可以分析在特殊的發(fā)育途徑中已知基因的作用規(guī)律。迄今為止,在斑馬魚中還不可能做到定點基因失活(targetedgenedisruption)。當前,最常用的定點基因失活方法是將嗎啉代(morpholino)注射到早期的胚胎中,嗎啉代其實就是修飾的反義寡核苷酸,能夠特異消減(knock-down)基因表達[42]。然而,與用胚胎細胞培養(yǎng)產(chǎn)生種系嵌合體和用胚胎性成纖維細胞核代替合子核而產(chǎn)生克隆斑馬魚兩種技術(shù)相比,能夠產(chǎn)生真正的基因敲除魚的方法才略顯曙光[43,41]。就正常發(fā)育而言,利用組織特異和途徑特異的基因消減或基因敲除的轉(zhuǎn)基因種系可以為在活體內(nèi)觀察動態(tài)過程提供可能性,以便理解這個基因在脊椎動物胚胎發(fā)育中是怎樣起作用和何時、何地起作用的。

除了篩選影響正常發(fā)育的突變以外,斑馬魚還可用于篩查阻斷特殊發(fā)育途徑的小分子。最近的研究顯示,8/1100合成的小分子對發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、耳或色素的正常形成有促進作用[44]。除了能發(fā)現(xiàn)影響正常發(fā)育的小分子以外,還可以用表型模擬人類疾病的魚篩選具有治療價值的小分子[45]。此外,熒光標記魚還可提高手工篩選的通量,并且可引導(dǎo)向自動篩選的方向發(fā)展。與此相關(guān)的生態(tài)發(fā)育生物學(xué)研究新領(lǐng)域,也將從熒光標記魚中受益。倘若調(diào)控途徑能夠受控于活體轉(zhuǎn)基因斑馬魚,這些魚就可以作為環(huán)境污染物的指示器而發(fā)揮重要作用[46]。據(jù)報道,有3種方法用轉(zhuǎn)基因斑馬魚檢測環(huán)境有害化學(xué)物:一種是利用攜帶了整合高拷貝數(shù)量的大腸桿菌穿梭載體的斑馬魚來測試環(huán)境誘變劑[47]。Udvadia等學(xué)者正在設(shè)計熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚,以此熒光定位的轉(zhuǎn)換(例如從細胞核到細胞質(zhì)位置)來測試誘變劑的活性,這種方法具有高通量篩選誘變劑的潛力;第二種方法利用標記轉(zhuǎn)基因斑馬魚,其熒光或熒光素酶受到一種啟動調(diào)

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  本文關(guān)鍵詞：斑馬魚基因工程的研究進展，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：141911