發(fā)布時間：2016-10-16 16:08

  本文關鍵詞：斑馬魚基因工程的研究進展，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

　遺傳學報　ActaGeneticaSinica,October2004,31(10):1167～1174ISSN0379-4172

TheResearchProgressofZebrafishGeneEngineering

WUYu-Ping,XIONGQian,ZHANGGuang-Xian,XUAn-Long

(TheOpenLaboratoryofMarineFunctionalGenomicsofStateHigh-TechDevelopment,

CollegeofLifeSciences,SunYat-senUniversity,Guangzhou510275,China)

Abstract:Theresearchprogressofzebrafishgeneengineeringisreviewed,inincludingtherecentexplosionstatusoftransgeniczebrafishlines,transgeneiczebrafishintargetedscreens,thedevelopmentoftransgenictechnologyinze-brafishaswellasthecurrenthotspotsandfutureperspectiveofzebrafishgeneengineering.Bynowthezebrafishgeneengineering,nucleartransplantationandchromosomesetmanipulationtechnologieshavebeenestablishedinChina.Withfirmfoundationofzebrafishcytogeneticsandembryology,wewillobtaingeneengineeringzebrafishwithgenetar-getingintegrationandpromotetheadvancementanddevelopmentofbiotechnologyinappliedresearchfieldinnearfu-ture.

Keywords:zebrafish;geneengineering

斑馬魚基因工程的研究進展

吳玉萍,熊　茜,張廣獻,徐安龍

(中山大學生命科學學院,國家“863”計劃海洋生物功能基因組開放實驗室,廣州　510275)

摘　要:對國內(nèi)外斑馬魚基因工程研究進展,包括最近獲得的大批轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系、靶向篩選的轉(zhuǎn)基因斑馬魚、斑馬魚轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展和斑馬魚基因工程的熱點問題與應用前景進行了綜述。指出我國已建立日趨成熟的斑馬魚轉(zhuǎn)基因技術、細胞核移植技術和染色體組操作技術,具有斑馬魚細胞遺傳學和胚胎學基礎,我國有望在不久的將來獲得定向整合的基因工程斑馬魚,并推動生物技術應用研究領域的進步和發(fā)展。關鍵詞:斑馬魚;基因工程

中圖分類號:Q341　　　文獻標識碼:A　　　文章編號:0379-4172(2004)10-1167-08

　　20世紀90年代開始啟動的“人類基因組計劃”(HGP)重點內(nèi)容之一是對模式生物的研究。具備脊椎動物分子發(fā)育生物學和人類基因組計劃模式種條件的斑馬魚,由于其易于進行細胞譜系分析并兼具酵母、線蟲、果蠅和小鼠式遺傳的特征而日益受到學者的關注。1981年,Streisinger[1]在《Nature》上發(fā)

表了關于斑馬魚克隆系的研究,隨后它的基因連鎖圖的構建成為突變基因克隆的開端[2]。

1　斑馬魚基因工程研究概況

斑馬魚的轉(zhuǎn)基因研究始于1988年[3,4],此后進

收稿日期:2003-10-17;修回日期:2004-02-13

基金項目:國家“863”計劃項目(編號:2002AA629010)、國家自然科學基金(編號:30371113)、廣東省科技計劃項目(編號:2003C20303)和珠海

市科技計劃項目(編號:PC200310043)資助[SupportedbytheNational“863”Project(No.2002AA629010),ChineseNationalNaturalScienceFoundation(No.30371113),theScienceandTechnologyProjectofGuangdongProvince(No.2003C20303)andtheScienceandTechnologyProjectofZhuhaiCity(No.PC200310043)]

作者簡介:吳玉萍(1963-),女,博士,副教授,研究方向:魚類遺傳學。E-mail:exwyp@zsu.edu.cn

1168遺傳學報　ActaGeneticaSinica　Vol.31　No.10　2004

展迅速。目前,國內(nèi)外已獲得大批轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系(表1)。例如:1992年,Lin等[5]把有色斑馬魚囊胚細胞注入白化種囊胚,得到有色素細胞的嵌合體,嵌合體與白化魚交配得到有色后代;移植轉(zhuǎn)lacZ基

因囊胚細胞也得到嵌合體,轉(zhuǎn)基因性狀可以傳遞給后代。斑馬魚轉(zhuǎn)基因技術對分析體內(nèi)細胞間相互作

用,作為動物模型探討發(fā)育、生長、繁殖等機理,以及闡明控制脊椎動物的發(fā)育機制等方面均具有重要意義。目前,斑馬魚卵母細胞體外成熟、配子發(fā)生和受精的調(diào)控機制、胚胎干細胞的分離、基因克隆及基因敲除等研究都已成為研究熱點。

表1　轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系

Table1　Transgeniczebrafishlines

表達分類Expressioncategory1無限制Unrestricted

pUSVCATRSV/lacZCMV/luciferasedHSP/CAT-NPT-BGALdHSP/HPTXenopusef1a/lacZ

PPPPP

pSV/hygro

轉(zhuǎn)植基因Transgene

載體VectorP

表達模式Expressionpattern無表達Notexpressed一批陽性

Batchassaypositive無表達

Notexpressed無表達Notexpressed無表達Notexpressed

5個種系自普遍存在至斑駁的表達

Fivelinesrangefromubiquitoustopatch

MoMLV/lacZRSV/neoXenopusef1a/GFP

RP

無表達Notexpressed2/4可檢測表達,普遍存在2/4withdetectableexpression,ubiquitous

Carpβactin/CAT

P

不均一表達,限制于軸向和軸旁的中胚層

Nonuniformexpressionlimitedtoaxialandparaxialmesoderm

Xenopusef1a/lacZZebrafishβactin/GFPXenopusef1a/GFPCarpβactin/CATCarpβactin/CATXenopusef1a/GFPntdMedakaβactin/GFPZebrafishef1a/H2BGFP

RPTPP+IPP+ITRP

無表達Notexpressed普遍存在Ubiquitous普遍存在Ubiquitous普遍存在Ubiquitous普遍存在Ubiquitous普遍存在Ubiquitous普遍存在Ubiquitous普遍存在(定位細胞核)Ubiquitous(nuclearlocaliza-tion)

2神經(jīng)系統(tǒng)Nervoussystem

Zebrafishislet1/GFPZebrafishHuC/GFP

PP

MouseHSP/lacZ

P

7/8非表達系,1個種系表達7/8nonexpressinglines;1lineexpressing頭蓋運動神經(jīng)元Cranialmotorneurons神經(jīng)系統(tǒng)Nervoussystem

32＊6

[20]

88241219100

＊

轉(zhuǎn)基因發(fā)生率(%)

Rateoftransgenesis

5＊7163316

參考文獻Reference[3][4][6][7][8][9]

167

[10][11]

7

[12]

83

[13][14][15][16][16][17][18][19]

[21][22]

WUYu-Pingetal.:TheResearchProgressofZebrafishGeneEngineering1169續(xù)表1

表達分類Expressioncategory

轉(zhuǎn)植基因Transgene

Goldfisha1tubulin/GFPZebrafishrodopsin/GFPRatGAP43/GFPZebrafishHuC/GFPZebrafishpax2.1/lacZ

載體VectorPPPPP

表達模式Expressionpattern神經(jīng)系統(tǒng)Nervoussystem視網(wǎng)膜桿狀體光感受器Rodphotoreceptors神經(jīng)系統(tǒng)Nervoussystem神經(jīng)系統(tǒng)

Nervoussystem

MHB,后腦,脊髓等

MHB,hindbrain,spinalcordetal.

轉(zhuǎn)基因發(fā)生率(%)

Rateoftransgenesis2～54＊31009

參考文獻Reference[23][24][25][19][26]

ZebrafishAANAT-2/GFP

3淋巴細胞Lymphoidcell

Zebrafishrag1/GFP

PPAC

松果腺光感受器Pinealphotoreceptor

容量最大載體,在胸腺腎、嗅覺神經(jīng)元中表達

Largestconstructexpressedinthymus,kidneyandolfactoryneurons

3n.a.

[27][28]

4上皮細胞Epithelia5胰腺Pancreas6肌肉Muscle

Zebrafishkrt8/GFPZebrafishinsulin/GFPZebrafisha-actin/GFPZebrafisha-actin/GFP

PPP+ITRPP+/-NLS

上皮細胞Epithelia胰腺Pancreas肌肉Muscle

肌肉Muscle

中間細胞和循環(huán)血液Intermediatecellmassandcir-culatingblood

16n.a.6281

[29][30][18][14][31]

7血液Blood8生殖細胞Germcells9脈管系統(tǒng)Vasculature

Zebrafishgata1/GFP

Zebrafishvasa/GFPZebrafishfli1/GFP

PP

生殖細胞Germcells

脈管系統(tǒng)、主動脈弓、頜、鰭間葉細胞

Developingvasculature,aorticarches,jaw,finmesenchyme

215

[32][33]

10熱激-誘導型Heatshock-inducible

Zebrafishhsp70/GFPZebrafishhsp/slit2-GFP

PP

熱激普遍存在

Ubiquitousuponheatshock熱激普遍存在

Ubiquitousuponheatshock

24

[34][35]

　　P:質(zhì)粒;P+I:具絕緣子的質(zhì)粒;P+NLS:質(zhì)粒和核定位序列多肽;T:轉(zhuǎn)座子;R:逆轉(zhuǎn)錄病毒;P+ITR:具反向末端重復的腺相關病毒的質(zhì)粒;PAC:P1人工染色體;＊:基于單個轉(zhuǎn)基因動物;n.a.:信息無效;lacZ:β-半乳糖苷酶基因;CMV:巨細胞病毒;CAT:氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶;HSP:熱激啟動子;GFP:綠色熒光蛋白;NPT:新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶;BGAL:β-半乳糖苷酶;HPT:潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶;MoMLV:莫洛尼氏剛果紅白血病毒。

P:plasmid;P+I:plasmidwithinsulatorelements;P+NLS:plasmid+nuclearlocalizationsequencepeptides;T:transposon;R:retrovirus;P+ITR:plasmidwithadeno-assoicatedvirusinvertedterminalrepeat;PAC:P1artificialchromosome;＊:basedonsingletransgenicanimal;n.a.:infor-mationnotavailable;lacZ:β-galactosidasegene;CMV:cytomegalovirus;CAT:chloramphenicolacetyltransferase;HSP:heatshockpromoter;GFP:greenfluorescentprotein;NPT:neomycinphosphotransferase;BGAL:β-galacosidase;HPT:hygromycinphospho-transferase;MoMLV:MoloneyMurineLeukemiaVirus.

　　1982年,Palmiter[36]等將大鼠生長激素基因轉(zhuǎn),“鼠”,這一突破性成果為動物基因工程定向育種研究,

1170遺傳學報　ActaGeneticaSinica　Vol.31　No.10　2004

生物研究所朱作言領導的實驗室在世界上率先開展了魚類基因工程定向育種研究,建立了完整的轉(zhuǎn)基因魚理論模型和完善的實驗技術體系,為轉(zhuǎn)基因魚育種奠定了理論基礎。目前,全世界有數(shù)十個

實驗室開展了魚類基因轉(zhuǎn)移研究,建立了顯微注射、電融合及精子攜帶法等多種基因轉(zhuǎn)移方法,獲得了快速生長的轉(zhuǎn)基因鯉、大馬哈魚、虹鱒、大西洋鮭和羅非魚等,規(guī)模化養(yǎng)殖實驗也在進行中。雖然基因工程定向育種技術已取得突破,但基因工程育種的目的還未能達到,外源基因的隨機整合、非可控表達及轉(zhuǎn)基因魚生物安全性等問題,嚴重影響了這一基因工程育種技術在魚類育種上的有效應用,成為制約轉(zhuǎn)基因魚研究進一步發(fā)展和推廣應用的瓶頸。因此,開辟一條基因工程育種新途徑的研究顯得十分迫切和必要。利用同源重組進行內(nèi)源基因修飾與可控表達及基因修飾魚克隆技術的建立,對魚類基因工程育種、生物反應器研制以及基因功能與表達調(diào)控和發(fā)育生物學研究,都具有重大理論指導意義和潛在應用價值。由于斑馬魚為模式魚,其遺傳背景清楚、繁殖周期短、產(chǎn)卵過程可人為控制、懷卵量大、體外受精、胚胎透明便于觀察等,并已具有成熟的轉(zhuǎn)基因技術,因而已成為魚類基因工程中基因同源重組、基因表達調(diào)控和基因功能研究的理想材料。

魚類克隆研究始于1963年,是由我國學者童第周教授等率先進行的。20世紀70年代,中國科學院水生生物研究所參與合作,克隆了第一尾鯉鯽囊胚細胞核移植魚。隨后在80年代,中國科學院水生生物研究所將魚類細胞培養(yǎng)與細胞核移植相結(jié)合,獲得第一例體細胞克隆脊椎動物,即腎細胞核移植鯽魚。轉(zhuǎn)基因克隆魚的研究,就是把基因轉(zhuǎn)移和克隆技術結(jié)合起來,應用于魚類,建立一套快速省時的魚類基因工程方法,為培育魚類新品種和建立生物反應器提供技術儲備。該項研究可以縮短培育純系轉(zhuǎn)基因魚的時間,提高目的基因整合率,具有廣泛的應用前景。目前,模式動物斑馬魚的細胞核移植研究已在國內(nèi)外實驗室獲得成功,鑒于斑馬魚的類胚胎干細胞研究已取得進展,它將為斑馬魚基因組定向整合技術奠定基礎,并有望在研究脊椎動物發(fā)育過程的基因功能、細胞核發(fā)育潛能及核質(zhì)關系等理論問題上發(fā)揮重要作用。

[39～41]

[37,38]

2　斑馬魚基因工程發(fā)展前景

2.1　靶向篩選的轉(zhuǎn)基因魚類

過去大部分的研究集中在利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚進行發(fā)育基因表達和活體形態(tài)發(fā)生等方面,今后須考慮利用熒光標記魚來篩查突變體、小分子或抑制正常發(fā)育的毒素。基因熒光標記魚類與反求遺傳學方法聯(lián)合起來可以分析在特殊的發(fā)育途徑中已知基因的作用規(guī)律。迄今為止,在斑馬魚中還不可能做到定點基因失活(targetedgenedisruption)。當前,最常用的定點基因失活方法是將嗎啉代(morpholino)注射到早期的胚胎中,嗎啉代其實就是修飾的反義寡核苷酸,能夠特異消減(knock-down)基因表達[42]。然而,與用胚胎細胞培養(yǎng)產(chǎn)生種系嵌合體和用胚胎性成纖維細胞核代替合子核而產(chǎn)生克隆斑馬魚兩種技術相比,能夠產(chǎn)生真正的基因敲除魚的方法才略顯曙光[43,41]。就正常發(fā)育而言,利用組織特異和途徑特異的基因消減或基因敲除的轉(zhuǎn)基因種系可以為在活體內(nèi)觀察動態(tài)過程提供可能性,以便理解這個基因在脊椎動物胚胎發(fā)育中是怎樣起作用和何時、何地起作用的。

除了篩選影響正常發(fā)育的突變以外,斑馬魚還可用于篩查阻斷特殊發(fā)育途徑的小分子。最近的研究顯示,8/1100合成的小分子對發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、耳或色素的正常形成有促進作用[44]。除了能發(fā)現(xiàn)影響正常發(fā)育的小分子以外,還可以用表型模擬人類疾病的魚篩選具有治療價值的小分子[45]。此外,熒光標記魚還可提高手工篩選的通量,并且可引導向自動篩選的方向發(fā)展。與此相關的生態(tài)發(fā)育生物學研究新領域,也將從熒光標記魚中受益。倘若調(diào)控途徑能夠受控于活體轉(zhuǎn)基因斑馬魚,這些魚就可以作為環(huán)境污染物的指示器而發(fā)揮重要作用[46]。據(jù)報道,有3種方法用轉(zhuǎn)基因斑馬魚檢測環(huán)境有害化學物:一種是利用攜帶了整合高拷貝數(shù)量的大腸桿菌穿梭載體的斑馬魚來測試環(huán)境誘變劑[47]。Udvadia等學者正在設計熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚,以此熒光定位的轉(zhuǎn)換(例如從細胞核到細胞質(zhì)位置)來測試誘變劑的活性,這種方法具有高通量篩選誘變劑的潛力;第二種方法利用標記轉(zhuǎn)基因斑馬魚,其熒光或熒光素酶受到一種啟動調(diào)

WUYu-Pingetal.:TheResearchProgressofZebrafishGeneEngineering1171

環(huán)境污染物如芳烴、重金屬和環(huán)境雌激素的影響[46];第三種可能性是利用組織限制的熒光標記魚來篩選對特殊發(fā)育途徑產(chǎn)生特別作用的環(huán)境毒素。綜上所述,轉(zhuǎn)基因斑馬魚不僅可以服務于闡明自然的發(fā)育事件,而且可以用來促進發(fā)育途徑中某些重要成分的發(fā)現(xiàn),以及評估環(huán)境對這些相同途徑的作用。

2.2　斑馬魚轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展

在大多數(shù)情況下,DNA顯微注射由于其相對操作簡單、效果可靠,仍為斑馬魚轉(zhuǎn)基因研究的主要方法。應用DNA顯微注射獲得斑馬魚種系轉(zhuǎn)基因頻

[48]

率為10%～30%,而在小鼠則為10%～

帶大范圍核酸酶(meganuclease)識別位點的轉(zhuǎn)基因載體一并注入,該項技術可產(chǎn)生高達30%的轉(zhuǎn)基因效率、50%的種系傳遞率和單拷貝或低拷貝數(shù)量的整合事件。如果這種方法同樣在斑馬魚轉(zhuǎn)基因

研究中也獲得成功,它將為大多數(shù)實驗室提供一種更加穩(wěn)定、高效、簡捷的轉(zhuǎn)基因方法。目前,Sanger中心已完成斑馬魚基因組測序及組裝,使得我們非常方便地利用序列信息鑒定和分離感興趣基因的啟動調(diào)控區(qū)域,序列信息還將使開展斑馬魚同源重組技術的實驗室受益,因為它使得內(nèi)源基因的切割、置換和修飾成為可能。這些技術,尤其是當它們被發(fā)展為僅需要簡單的DNA注射時,便使斑馬魚成為分析蛋白質(zhì)結(jié)構和功能的理想工具。2.3　斑馬魚基因工程的熱點問題與應用前景

魚類胚胎干細胞和基因靶向操作的研究目前尚處于起步階段,盡管在斑馬魚和青鳉上已經(jīng)建立了類ES細胞系,在青鳉上也獲得了ES細胞移植的嵌合體,但迄今為止尚未得到能傳遞給后代的種系嵌合體,而這一步對于進行魚類基因靶向操作是至關重要的一步。在基因靶向操作技術方面,目前已構建了斑馬魚生長激素基因同源重組載體(吳玉萍等,待發(fā)表)和青鳉p53基因同源重組載體;有學者預測魚類基因靶向操作的研究將在斑馬魚或青鳉上首先獲得成功,隨后將向經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類推廣。2002年,Lee等[41]在國際上首次將整合外源綠色熒光蛋白(GFP)基因的斑馬魚長期培養(yǎng)的胚胎細胞核移植到同種魚的去核卵中,研制出了可成活的二倍體后代。這一重大進展為細胞核移植在魚類基因工程育種上的應用奠定了重要基礎。因此,細胞核移植和胚胎干細胞培養(yǎng)及基因靶向操作技術相結(jié)合,在魚類基因工程育種應用上前景廣闊。

斑馬魚基因工程中的基因敲除技術可以使我們極為精確的操作單個基因,遺傳改變非常清楚,可以研究以前經(jīng)典遺傳學無法了解的基因表達效應,對于搞清每個基因的作用無疑是一個重要的里程碑。但這一技術也帶來一些難以預見的問題。近來人們爭論的焦點是動物機體是否有冗余基因,基因敲除模型的表型是否是由突變的靶基因造成的。目前,基因敲除的結(jié)果部分忽略了背景基因的作用,由于敲除基因的缺失,機體可能產(chǎn)生一種雪崩式的代償過程,引起基因的第二次改變,因此有理由相信一個[54,55]

[53]

40%。在小鼠和斑馬魚中,通常導致轉(zhuǎn)基因多聚

體的單一整合。復雜整合事件將為染色體內(nèi)重組提供基本條件,并將導致表達變異。為了充分利用斑馬魚和其他脊椎動物模型,降低整合位點的復雜性,減少嵌合體和提高轉(zhuǎn)基因效率,目前又發(fā)展了其他轉(zhuǎn)基因方法。

對于斑馬魚,可采用擬型反轉(zhuǎn)錄病毒感染方法。早期采用反轉(zhuǎn)錄病毒介導的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?沒有產(chǎn)生基因表達作用[9,13]。隨后有學者報道,整合進入病毒載體的非病毒啟動子或基因捕獲確認的內(nèi)源基因啟動子調(diào)控的報道基因可以獲得表達[48,50]。這種方法非常高效,每個轉(zhuǎn)基因奠基者平均有25個獨立分開的單拷貝插入序列[50]。然而,反轉(zhuǎn)錄病毒介導的轉(zhuǎn)基因所需的構建、包裝、滴定和感染是一個相當長的過程,遠不適應于常規(guī)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚啟動子或基因功能的分析。

第二種產(chǎn)生單拷貝轉(zhuǎn)基因插入序列的方法是利用轉(zhuǎn)座子操作[51,52]。相對于反轉(zhuǎn)錄病毒操作而言,轉(zhuǎn)座子具有兩大優(yōu)勢:1)它可以建立更大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因體系;2)其準備時間與DNA顯微注射技術相近。這種方法的主要缺陷是效率極低,整合不到位,而且質(zhì)粒DNA多聚體為隨機整合[52]。

還有一種轉(zhuǎn)基因替代方法適用于盤基網(wǎng)柄菌(Dictyostelium),是將轉(zhuǎn)染的精核注入蛙卵原核,可產(chǎn)生60%～80%轉(zhuǎn)基因胚胎。受試的F0代中100%可產(chǎn)生攜帶并表達基因的后代。盡管此種方法與DNA顯微注射相比,需要更高的技術支撐,但它在斑馬魚基因工程應用中前景樂觀[18]。

最近,在轉(zhuǎn)基因青鳉中報道了一種更簡捷的方法[49]

博泰典藏網(wǎng)btdcw.com包含總結(jié)匯報、自然科學、農(nóng)林牧漁、醫(yī)藥衛(wèi)生、求職職場、教學研究、出國留學以及斑馬魚基因工程的研究進展_吳玉萍等內(nèi)容。

本文共2頁12

  本文關鍵詞：斑馬魚基因工程的研究進展，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：141910