本文關(guān)鍵詞：速生植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因的克隆和功能研究　出處：《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：氮素是植物生長發(fā)育必需的營養(yǎng)元素,也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中化肥施用最多的元素。在其他營養(yǎng)元素均得到滿足時,對于大多數(shù)農(nóng)作物產(chǎn)量增加而言,土壤中的氮素是限制因素。硝酸鹽是土壤中氮素存在和多數(shù)植物吸收利用氮素的主要形態(tài),但硝酸鹽很容易溶解在土壤溶液里,造成氮素營養(yǎng)的流失,威脅環(huán)境。植物在吸收利用硝酸鹽的的過程中硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白起著關(guān)鍵作用,研究硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白對提高植物氮素利用效率,提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量,解決因氮素流失造成的環(huán)境污染等問題具有重要的意義。對矮珍珠(Glossostigma elatinoides)、小水榕(Anubias nana)、黑藻(Hydrilla verticillata)、金魚藻(Ceratophyllum demersum)等20種水生植物的生長速度進行研究發(fā)現(xiàn),矮珍珠、金魚藻、黑藻和小水榕的生長速度最快,0.5g健壯莖枝生長4周后濕重分別增長362%、372%、376%和402%。為了克隆這些植物中的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因,本研究對GenBank中已知的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸序列進行比對,得到保守序列,設(shè)計簡并引物,進行PCR擴增,成功從矮珍珠中克隆得到硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因GeNRT1.1、GeNRT2.1。多形漢遜酵母基因組中只有一個硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因(YNT1),缺陷型多形漢遜酵母(△ynt)在氮素存在的條件下不能正常生長,基于這一原理,本研究利用缺陷型多形漢遜酵母外源表達系統(tǒng)對矮珍珠硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白GeNRT1.1、GeNRT2.1和硅藻(Cylindrotheca fusiformis)硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白CfNAT進行功能鑒定。主要研究進展如下:1.成功從矮珍珠(Glossostigma elatinoides)中克隆得到低親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因GeNRT1.1并進行了Genebank登錄,登錄號為KX237655,該基因序列全長1797bp,包含1440bp的完整的開放閱讀框,編碼480個氨基酸。和煙草、擬南芥已知低親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白具有較高的序列相似性74.1%和62.4%。將該基因轉(zhuǎn)化缺陷型多形漢遜酵母(△ynt)發(fā)現(xiàn),能使缺陷型酵母恢復(fù)生長,表明GeNRT1.1具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運功能,其Km值為1200μM。一般認(rèn)為,當(dāng)Km1000μM為高親和轉(zhuǎn)運蛋白;當(dāng)Km1000μM為低親和轉(zhuǎn)運蛋白,因此GeNRT1.1應(yīng)該是一種低親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白。實時熒光RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),GeNRT1.1在莖和葉中的表達量較高,是根中表達量的3.5倍。在高濃度硝酸鹽(2mM)誘導(dǎo)下,GeNRT1.1基因在根、莖、葉中表達量均高于低濃度(0.5mM),該結(jié)果進一步證實GeNRT1.1是一種低親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白。2.成功從矮珍珠中克隆得到高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因GeNRT2.1,并進行了Genebank登錄,登錄號:KX230796。該基因全長2078bp,包含1596bp的完整的開放閱讀框,編碼530個氨基酸。氨基酸序列分析表明GeNRT2.1是跨膜蛋白,屬于MFS家族。將該基因轉(zhuǎn)化缺失YNT1的多形漢遜酵母(△ynt),在培養(yǎng)基中硝酸鹽濃度低到500μM時表達了GeNRT2.1的多形漢遜酵母(△ynt)仍可正常生長,Km值約為041μM,這表明GeNRT2.1基因是一個高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因。實時熒光定量RT-PCR結(jié)果表明,GeNRT2.1在根中表達量最高,且受到低濃度NO3-的誘導(dǎo),在500μM環(huán)境中表達量上調(diào),進一步證明GeNRT2.1為高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白。3.為研究目的基因的亞細(xì)胞定位,分別構(gòu)建植物表達載體p35S::GeNRT1.1-GFP/RTL和p35S::GeNRT2.1-GFP/RTL轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體,激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),p35S::GeNRT1.1-GFP/RTL-和p35S::GeNRT2.1-GFP/RTL均定位于原生質(zhì)體的細(xì)胞膜上,這表明GeNRT1.1和GeNRT2.1編碼的是一種膜蛋白。4.比較GeNRT1.1、GeNRT2.1和CfNRT對缺陷型酵母的影響發(fā)現(xiàn),△ynt-CfNRT、△ynt-GeNRT1.1和△ynt-GeNRT2.1在相同時間里對硝酸鹽的吸收速率不同。相同的條件下轉(zhuǎn)△ynt-CfNRT能夠更快的達到吸收速率的最大速度,這預(yù)示CfNRT的功能可能比GeNRT1.1、GeNRT2.1更強。5.CfNRT對轉(zhuǎn)基因煙草生長的影響。為驗證CfNRT基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的功能,我們將T2代轉(zhuǎn)基因煙草、非轉(zhuǎn)基因煙草分別播種在MS0、3?6 N、2?6 N、1?6 N、1/16 N、1/32 N(氮含量分別為MS0培養(yǎng)基中氮含量的3/6、2/6、1/6、1/16、和1/32)培養(yǎng)基中,T2代轉(zhuǎn)基因煙草播種27天發(fā)現(xiàn),在MS0培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)基因、非轉(zhuǎn)基因煙草苗生長狀況沒有明顯差別,3?6 N培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)基因煙草比播種在相同培養(yǎng)基中的非轉(zhuǎn)基因煙草的葉片大1-3倍、顏色濃綠。1/16 N培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)基因煙草生長情況良好,缺氮癥狀不明顯,非轉(zhuǎn)基因煙草生長明顯受到抑制。播種后61d測定轉(zhuǎn)基因煙草、非轉(zhuǎn)基因煙草鮮重、干重發(fā)現(xiàn):煙草在MS0過量氮至1/6 N的條件下,單株鮮重及干重基本維持在同一水平(鮮重138.0-201.3 mg;干重16.6-29.9 mg),當(dāng)?shù)抵?/16及1/32時,植物生長受到明顯抑制,鮮重(30.8-65.5 mg)及干重(5.3-10.0 mg)顯著降低。但轉(zhuǎn)基因煙草鮮重和干重都高于非轉(zhuǎn)基因煙草。節(jié)氮結(jié)果表明,如果以1/8 N為標(biāo)準(zhǔn),轉(zhuǎn)基因煙草可節(jié)約50%氮使用量。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2

【參考文獻】

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本文編號：1333118