發(fā)布時(shí)間：2017-12-21 23:02

  本文關(guān)鍵詞：魚腥藻PCC 7120中幾個(gè)固氮相關(guān)基因的功能驗(yàn)證　出處：《華南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：魚腥藻PCC 7120(Anabaena sp.PCC 7120)在細(xì)菌發(fā)育學(xué)和多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究中,是一種典型的模式生物。在缺乏化合氮源的環(huán)境中,絲狀體中的營養(yǎng)細(xì)胞能分化成為具有特殊結(jié)構(gòu)的異形胞。主要研究內(nèi)容如下:在實(shí)驗(yàn)室研究基礎(chǔ)上,選擇可能與固氮有關(guān)的靶基因,利用p ZR606敲除某一個(gè)靶基因,觀察敲除菌株在不含有化合氮源上的培養(yǎng)條件下的表型變化,確定可能與魚腥藻PCC 7120細(xì)胞固氮相關(guān)的基因;選用含有Pgln A強(qiáng)啟動子的pZR670質(zhì)粒作為互補(bǔ)表達(dá)質(zhì)粒,構(gòu)建含有靶基因啟動子序列的互補(bǔ)型表達(dá)質(zhì)粒,觀察互補(bǔ)菌株是否在恢復(fù)一定的表達(dá)后能使細(xì)胞在缺少化合氮源的培養(yǎng)基上恢復(fù)生長,從而確定與固氮相關(guān)的基因;通過分析魚腥藻PCC 7120的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),選擇在缺氮和有氮條件下不同表達(dá)量的sRNA,利用pZR670構(gòu)建干涉質(zhì)粒,通過三親接合轉(zhuǎn)移方法獲得干涉菌株,觀察干涉在培養(yǎng)過程中所引起的細(xì)胞形狀的變化,確定能引起魚腥藻PCC 7120細(xì)胞型狀改變的sRNA序列。主要研究結(jié)果如下:取生長狀態(tài)良好的魚腥藻PCC 7120細(xì)胞,接種于AA/8和AA/8N液體中培養(yǎng),通過測量魚腥藻PCC 7120細(xì)胞在700 nm處的吸光度值,觀察細(xì)胞的生長狀態(tài),通過生長曲線分析,氮源是細(xì)胞生長的一種限制性因素,也是異形胞形成的關(guān)鍵元素。成功利用單交換基因重組技術(shù),以p ZR606質(zhì)粒為基本骨架,構(gòu)建了all2022、all2676、alr0834基因的敲除質(zhì)粒pHEP52、pHEP34和pHEP55,敲除了all2022、all2676、alr0834基因,獲得了基因敲除菌株Δall2022、Δall2676、Δalr0834,在不含有化合氮源的AA培養(yǎng)基上培養(yǎng),觀察其生長變化狀態(tài),發(fā)現(xiàn)此三種敲除菌株在不含化合氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下,魚腥藻PCC 7120在培養(yǎng)一段時(shí)間后均會變黃死亡。成功利用表達(dá)質(zhì)粒pZR670構(gòu)建了all2022、all2676、alr0834基因的互補(bǔ)質(zhì)粒pHEP90、pHEP91、pHEP92,通過三親結(jié)合轉(zhuǎn)移獲得其互補(bǔ)菌株▲all2022、▲all2676、▲alr0834,將獲得的互補(bǔ)菌株在不含有化合氮源的AA培養(yǎng)基中培養(yǎng),▲all2676和▲alr0834在培養(yǎng)一段時(shí)間后能恢復(fù)生長,而▲all2022不能恢復(fù)正常生長。由此可以初步確定all2676和alr0834是與魚腥藻PCC 7120細(xì)胞的固氮過程有關(guān)的基因,而all2022可能是因?yàn)槭悄硞�(gè)操縱子的中間位置的基因而出現(xiàn)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的極效應(yīng)現(xiàn)象基因。成功利用pZR670質(zhì)粒構(gòu)建了多個(gè)具有能轉(zhuǎn)錄含有sRNA互補(bǔ)序列的干涉質(zhì)粒,并利用三親結(jié)合轉(zhuǎn)移技術(shù)成功獲得了含有干涉質(zhì)粒的菌株,將干涉菌株在AA/16N和AA/16固體培養(yǎng)基上和AA/8N液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng),對比其生長變化情況,發(fā)現(xiàn)含有能轉(zhuǎn)錄包含sRNA0425反向序列的質(zhì)粒的干涉菌株在AA/8N液體培養(yǎng)中,細(xì)胞極易貼壁生長,含有能轉(zhuǎn)錄包含sRNA1064反向序列的質(zhì)粒的干涉菌株培養(yǎng)一段時(shí)間后細(xì)胞不能形成長的絲狀體,每一個(gè)絲狀體含有的細(xì)胞數(shù)目絕大部分不超過30個(gè)。
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1317479