本文關(guān)鍵詞：梭梭再生體系研究及HaDREB2C基因的克隆與分析

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【摘要】：梭梭是中亞荒漠中分布最廣的荒漠植被類型,具有超強的適應(yīng)干旱能力,抗鹽性能強,采用組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)可能是獲得優(yōu)質(zhì)、整齊梭梭苗木的一條有效途徑,對保護和繁衍這一珍稀瀕危植物種有積極意義,對梭梭分子層面研究也有重要的研究意義。就梭梭再生體系的建立而言,常采用的外植體為同化枝、莖段、下胚軸、子葉。本實驗利用梭梭同化枝為外植體,對梭梭再生體系的研究,是為了建立梭梭遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定良好的基礎(chǔ);DREB轉(zhuǎn)錄因子家族的成員普遍存在于擬南芥、玉米、番茄、煙草和水稻等多種植物中,并參與調(diào)控各種功能基因的表達,但目前對梭梭的分子生物學研究還處于起步階段。本研究對從沙生植物梭梭中新克隆的HaDREB2C轉(zhuǎn)錄因子基因的基本特性及生物學功能進行了系統(tǒng)的研究,證明這個基因具有DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因的基本特性,這些結(jié)果為深入了解這個基因調(diào)控植物脅迫應(yīng)答反應(yīng)的分子機理提供了理論基礎(chǔ),也為運用基因工程的方式改良植物的抗逆境性能供應(yīng)了優(yōu)良的被選基因。通過轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄程度上調(diào)控目的基因的表達,是植物對其成長發(fā)育及生理代謝調(diào)控的一種非常重要的方式。主要研究結(jié)果如下:(1)建立梭梭愈傷組織誘導和分化再生體系。本實驗是以MS為基本培養(yǎng)基,設(shè)計不同組別的植物生長調(diào)節(jié)劑和質(zhì)量濃度配比,研究生長調(diào)節(jié)劑對梭梭愈傷組織形成和分化的影響。結(jié)果梭梭同化枝為誘導愈傷組織形成的最優(yōu)外植體,1.0 mg/L 2,4一二氯苯氧乙酸(2,4-D)與1.0 mg/L KT可誘導梭梭愈傷組織形成,有利于愈傷組織分化成芽。(2)在前期對干旱脅迫的梭梭材料經(jīng)過高通量轉(zhuǎn)錄組測序后,根據(jù)測序結(jié)果對基因表達差異進行分析,篩選到了一個差異性表達序列,命名它為HaDREB2C,據(jù)此設(shè)計基因特異引物,通過RT-PCR克隆出HaDREB2C轉(zhuǎn)錄因子基因(登錄號為KU523927),氨基酸序列比對表明,該個基因為典型的DREB2轉(zhuǎn)錄因子基因。(3)根據(jù)生物信息學軟件及在線軟件分析,HaDREB2C對應(yīng)的ORF長度為1125 bp,編碼1個長度為347個氨基酸的蛋白質(zhì),在線預測結(jié)果表明,該基因為非分泌性親水蛋白,且不存在跨膜結(jié)構(gòu)。半定量RT-PCR對這個基因在不同脅迫條件下的表達情況進行了檢測,結(jié)果顯示:這個基因的表達均受干旱、高鹽環(huán)境逆境的誘導。(4)構(gòu)建1個酵母表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)進酵母菌株AH109中,并分別在缺失色氨酸的SD(SD-Trp)培養(yǎng)基和缺少色氨酸、組氨酸和腺嘌呤的SD(SD-Trp-His-Ade)三缺陷培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化子。酵母實驗表明,Ha DREB2C能夠在三缺平板上生長,β-半乳糖苷酶活性濾紙顯色反應(yīng)能呈現(xiàn)明顯的藍色,初步在酵母體中通過轉(zhuǎn)錄激活實驗驗證此轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活功能。(5)構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA1304-HaDREB2C利用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草,獲得轉(zhuǎn)基因煙草。
【學位授予單位】：新疆農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2

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本文編號：1304485