本文關(guān)鍵詞：中華大蟾蜍色氨酸羥化酶BbgTPH1基因的克隆、原核表達(dá)及功能鑒定

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【摘要】：色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase I,TPH1)是催化色氨酸生成5-羥色胺的限速酶,而5-羥色胺不僅是蟾酥的主要活性成分,同時也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì),具有重要的生理功能。本研究從中華大蟾蜍耳后腺文庫中克隆得到中華大蟾蜍色氨酸羥化酶c DNA。構(gòu)建原核重組融合表達(dá)質(zhì)粒p MAL-Bbg TPH1,將其導(dǎo)入Escherichia coli TB1中,用IPTG誘導(dǎo)重組菌并優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件。以色氨酸為底物進(jìn)行體外酶促反應(yīng),采用LC-MS法鑒定反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果顯示Bbg TPH1基因c DNA全長為1 984 bp,開放閱讀框1 443 bp,編碼480個氨基酸,推測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為55.2 k Da,理論等電點為5.58,具有芳香族類羥化酶超基因家族的保守結(jié)構(gòu)域和芳香族類羥化酶家族特有的特征信號序列。氨基酸比對分析表明,該基因編碼的氨基酸與其他物種TPH1蛋白序列具有較高的同源性。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示Bbg TPH1與非洲爪蟾的TPH1親緣關(guān)系最近。Bbg TPH1在E.coli TB1中能夠高效表達(dá),其優(yōu)化表達(dá)條件為誘導(dǎo)溫度20℃、IPTG濃度0.5 mmol·L-1。酶活檢測結(jié)果顯示,重組Bbg TPH1具有較高催化活性,可將色氨酸轉(zhuǎn)化為5-羥色氨酸。本研究首次獲得了蟾蜍屬動物色氨酸羥化酶全長c DNA序列,并驗證了其催化功能,為進(jìn)一步研究蟾蜍中蟾毒色胺類化合物的生物合成分子機(jī)制以及次生代謝調(diào)控等提供了科學(xué)依據(jù)。
【作者單位】： 沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院;沈陽藥科大學(xué)中韓分子生藥學(xué)研究室;沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院;
【基金】：遼寧省自然科學(xué)基金資助項目(2015020741) 沈陽藥科大學(xué)歸國人員科研啟動基金資助項目(GGJJ2015101)
【分類號】：Q78;Q55
【正文快照】： 共同第一作者.中華大蟾蜍(B.bufo gargarizans)耳后腺的干燥分泌物,即蟾酥,為我國傳統(tǒng)貴重中藥材[1,2],其化學(xué)成分復(fù)雜,主要含蟾蜍毒素類(bufotoxins)、蟾毒配基類(bufogenins)和蟾毒色胺類(bufotenines)化合物[3]。有文獻(xiàn)報道蟾毒色胺類化合物蟾蜍丁酸(bufobutanoic acid)和

【相似文獻(xiàn)】

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1 田喜梅,胡西e，

本文編號：1300070