發(fā)布時間：2017-12-14 12:18

  本文關(guān)鍵詞：鋁脅迫下大豆STOP1同源基因的克隆及功能的初步分析

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【摘要】：酸性土壤約占全世界總耕地面積的30-40%,已成為全球農(nóng)業(yè)發(fā)展的限制性因素之一。在酸性土壤(p H≤5.0)中,質(zhì)子(H+)也會對敏感的植物造成傷害,同時因酸度增加,鋁溶解形成Al3+,達(dá)到一定濃度時產(chǎn)生毒害,抑制根尖的伸長,從而影響作物對水分和營養(yǎng)的吸收,進(jìn)而影響作物的產(chǎn)量。C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子STOP1(sensitive to proton 1)和ART1(Al resistance transcription factor 1)在擬南芥和水稻中的分別報道推進(jìn)了植物抗酸鋁的研究,二者均為轉(zhuǎn)錄因子,在酸和鋁信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中處于較上游位置,調(diào)節(jié)了下游一系列抗鋁毒或質(zhì)子毒害的基因,從而在適應(yīng)低p H和鋁毒中起重要作用。在NCBI數(shù)據(jù)庫中,通過BLAST發(fā)現(xiàn)大豆基因組共有5個STOP1同源基因,本實驗以大豆耐鋁品種吉育70和鋁敏感品種吉育62作為實驗材料,對大豆5個STOP1基因進(jìn)行功能分析,探討它們在大豆耐鋁中的作用。具體實驗內(nèi)容如下:1.以鋁處理4小時的吉育70根尖c DNA為模板,克隆得到5個At STOP1同源的大豆基因,分別命名為Gm STOP1a,Gm STOP1b,Gm STOP1c,Gm STOP1d,Gm STOP1e。5個同源基因編輯的蛋白質(zhì)均具有C2H2型鋅指蛋白的4個鋅指保守區(qū)域。進(jìn)化樹分析表明Gm STOP1a與At STOP1的同源性較高,其它4個與At STOP2的同源性較高。2.通過實時定量PCR對5個基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平分析。從時間段實驗來看,五個基因均為組成型表達(dá),25μmol Al Cl3處理24小時內(nèi)表達(dá)趨勢一致,均為2小時時表達(dá)豐度上升,4小時時達(dá)到峰值,之后24小時內(nèi)保持下降趨勢,但Gm STOP1a和Gm STOP1e表達(dá)豐度高于其他三個。在耐鋁品種吉育70和鋁敏感品種吉育62中,Gm STOP1a,Gm STOP1c,Gm STOP1d基因在兩個品種間差異不大,Gm STOP1b,Gm STOP1e在4小時時在兩個品種間轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異較大,且上調(diào)水平較高。對土壤生長的大豆植株田間取樣后的組織定位研究表明,五個大豆STOP1基因在大豆的各個組織都有表達(dá),在根和莢中表達(dá)量較多,利用水培分根段的轉(zhuǎn)錄表達(dá)研究表明,STOP1在根部的表達(dá)主要集中在根尖0-1cm處。對吉育70進(jìn)行銅、鑭、鉻等金屬脅迫處理表明,除鋁外,五個大豆STOP1基因的轉(zhuǎn)錄豐度在銅脅迫下也會上調(diào)。3.通過Gateway系統(tǒng)構(gòu)建了35S:STOP1:GFP表達(dá)載體,重組載體及空載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入擬南芥原生質(zhì)體,用共聚焦顯微鏡觀察綠色螢光信號,發(fā)現(xiàn)5個基因編碼的蛋白均定位于細(xì)胞核。將5個STOP1同源基因基因構(gòu)建到自激活載體p Bridge上,通過在SD-Trp-His培養(yǎng)基上培養(yǎng),得到5個STOP1同源基因的自激活抑制濃度。綜合以上結(jié)果分析大豆五個STOP1同源基因可能均具有轉(zhuǎn)錄因子的活性。4.將5個基因構(gòu)建到含有-LUC標(biāo)簽的植物表達(dá)載體p EGAD-3XHA-LUC上,將重組的融合表達(dá)載體及空載通過農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)轉(zhuǎn)化侵染大豆子葉,獲得轉(zhuǎn)化成功的大豆發(fā)根;通過農(nóng)桿菌Agl0介導(dǎo)轉(zhuǎn)化侵染擬南芥,獲得T1代轉(zhuǎn)基因種子。五個基因的功能待進(jìn)一步分析驗證。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S565.1;Q943.2

【相似文獻(xiàn)】

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1 劉榮坤;鋁脅迫下大豆STOP1同源基因的克隆及功能的初步分析[D];吉林大學(xué);2016年

2 黃雨涵;利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選擬南芥耐鋁相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子STOP1互作蛋白[D];吉林大學(xué);2015年

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本文編號：1287868