本文關(guān)鍵詞：新型枯草桿菌基因敲除和表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建與納豆激酶基因的克隆

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【摘要】：納豆激酶(Nattokinase,NK)是一種早在1987年就由日本的Sumi H科學(xué)家在納豆中發(fā)現(xiàn)的堿性絲氨酸蛋白酶,而納豆是由枯草芽孢桿菌發(fā)酵而成的,該產(chǎn)品被譽為“超級健康食品”,是21世紀(jì)受眾人追捧的營養(yǎng)健康食品。該產(chǎn)品在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的價值極為突出。納豆激酶對緩解心腦血管類病癥,降低血粘度,降血壓,降血脂,預(yù)防骨質(zhì)疏松及糖尿病,及對木制纖維和皮毛的降纖作用等方面都有非常顯著的效果。為此,針對其進行進一步探索研究,對保健類藥物及保健食品的開發(fā)具有重要意義。但是目前就我們所知,盡管一直以來它的作用功效一直被大眾所追捧,但是在表達(dá)水平上仍然有待進一步提高,在底物特異性和活性等方向上也需要進一步優(yōu)化。本研究采用缺失蛋白酶的WB800枯草芽孢桿菌菌株作為表達(dá)菌株,進行納豆激酶的克隆和表達(dá)。該菌株能有效的緩解了以往枯草芽孢桿菌菌株表達(dá)產(chǎn)物易于被蛋白酶降解的不足。為了實現(xiàn)納豆激酶基因在枯草芽孢桿菌基因組中的融合表達(dá),本研究還成功的構(gòu)建了Knock plasmidnew質(zhì)粒載體,該載體可以同時滿足枯草芽孢桿菌中基因敲入和敲除的需要。利用該質(zhì)粒通過線性化DNA的胞內(nèi)同源重組,可有效避免以往基因敲入敲除過程中需要反復(fù)構(gòu)建質(zhì)粒的復(fù)雜操作,可以使操作步驟更加簡便化。另外,現(xiàn)有的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒只能夠在大腸桿菌中進行復(fù)制,然后再在枯草芽孢桿菌中進行表達(dá)。但是在構(gòu)建隨機突變庫進行高通量篩選的過程中,這一穿梭系統(tǒng)顯然效率很低。如果能夠在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中同時進行表達(dá),則可以顯著減少工作量,而且對酶的定向進化和蛋白突變庫的篩選尤為重要。因此,本研究中我們致力于雙表達(dá)質(zhì)粒載體pSHUTTLE-1-NATTO的構(gòu)建工作。該質(zhì)粒具有大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的復(fù)制子,并設(shè)計了分別能在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中作用的啟動子。此外,對質(zhì)粒中核糖體識別位點(RBS)進行了改造,使得該RBS兼具大腸桿菌和枯草芽孢桿菌RBS的基本特征。基于以上特點,新構(gòu)建的重組質(zhì)�？赡軐崿F(xiàn)在兩個菌中都能夠蛋白表達(dá)。同時,本文還針對納豆激酶進行了生物信息學(xué)分析。上述研究,為納豆激酶的基因的高效表達(dá),分子定向改造和深入研究奠定了基礎(chǔ)。此外,我們對現(xiàn)有的枯草芽孢桿菌基因提取方法進行了改進,建立起了一種更加簡便,快速,高效的方法。為了檢測該方法的使用范圍,我們還將該方法應(yīng)用于菠菜、魚和其它微生物總DNA的提取,發(fā)現(xiàn)該方法同樣有效。所提取的DNA具有產(chǎn)量高、品質(zhì)好、無污染等優(yōu)點,而且提取速度和簡便程度顯著優(yōu)于以往的其它方法。據(jù)了解,目前還沒有植物、動物和微生物細(xì)胞DNA提取的通用方法,因此本方法的建立不僅為本研究奠定了基礎(chǔ),也為相關(guān)研究提供了有益的參考。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：TS201.3;Q78

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9 柴q，

本文編號：1284875