本文關(guān)鍵詞：表觀遺傳基因?qū)λダ洗笫蟛G丸組織退行性變的作用及何首烏飲干預機制

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【摘要】：目的:探討表觀遺傳基因?qū)λダ洗笫蟛G丸組織退行性變的作用及何首烏飲干預機制。方法:1.Wistar雄性大鼠60只,隨機分為六組:青年對照組、自然衰老組、何首烏飲組、何首烏組、肉蓯蓉組、懷牛膝組,每組10只。其中青年對照組于12月齡處死取材;何首烏飲組、何首烏組、肉蓯蓉組和懷牛膝組從16月齡開始分別灌胃何首烏飲、何首烏提取液、肉蓯蓉提取液和懷牛膝提取液,自然衰老組灌胃等量生理鹽水,連續(xù)60 d。取青年對照組、自然衰老組和何首烏飲組大鼠睪丸組織適量進行DNA甲基化芯片檢測,篩選甲基化差異基因,并進行相關(guān)生物信息學分析。2.采用甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)檢測青年對照組、自然衰老組、何首烏飲組、何首烏組、肉蓯蓉組及懷牛膝組睪丸組織表觀遺傳基因AXL、C-myb、Ttc29、MAPK10、wnt2b的甲基化水平。3.采用熒光定量PCR技術(shù)檢測青年對照組、自然衰老組、何首烏飲組、何首烏組、肉蓯蓉組及懷牛膝組睪丸組織表觀遺傳基因AXL、C-myb、Ttc29、MAPK10、wnt2b的m RNA表達水平。4.采用免疫熒光染色技術(shù)觀察青年對照組、自然衰老組、何首烏飲組、何首烏組、肉蓯蓉組及懷牛膝組睪丸組織溴脫氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine,BrdU)的表達情況。結(jié)果:1.甲基化芯片篩選結(jié)果甲基化芯片共篩選出青年對照組和自然衰老組的差異甲基化基因共1728個,其中受何首烏飲直接調(diào)控的差異甲基化基因有238個。自然衰老組1176個基因的甲基化水平較青年對照組升高,何首烏飲用藥后使其中135個基因甲基化水平下降;自然衰老組552個基因甲基化水平較青年對照組降低,何首烏飲用藥后,使其中103個基因甲基化水平增加。通過GO分析和Pathway分析顯示,這238個基因分布于23條信號通路上,這些信號通路與疾病、細胞增殖和凋亡、細胞粘附等有關(guān)。2.MSP技術(shù)檢測AXL、C-myb、Ttc29、MAPK10、wnt2b的甲基化水平MSP檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),與自然衰老組比較,青年對照組、何首烏飲組、何首烏組、肉蓯蓉組、懷牛膝組AXL、wnt2b、MAPK10甲基化百分比明顯升高(P0.05),其中肉蓯蓉組、懷牛膝組甲基化百分比明顯低于何首烏飲組(P0.05),何首烏組與何首烏飲組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);C-myb、Ttc29甲基化百分比明顯降低(P0.05),其中,何首烏組、肉蓯蓉組、懷牛膝組甲基化百分比較何首烏飲組明顯升高(P0.05),青年對照組與何首烏飲組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.qRT-PCR技術(shù)檢測AXL、C-myb、Ttc29、MAPK10、wnt2b的mRNA表達水平qRT-PCR技術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),與自然衰老組比較,青年對照組、何首烏飲組、何首烏組、肉蓯蓉組、懷牛膝組wnt2b、MAPK10表達水平均明顯降低(P0.05),AXL、Ttc29、C-myb表達水平均明顯升高(P0.05);和何首烏飲組比較,懷牛膝組Wnt2b表達水平明顯升高(P0.05),AXL、Ttc29、C-myb表達水平明顯下降(P0.05),青年對照組與何首烏飲組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.BrdU染色結(jié)果利用免疫熒光染色技術(shù)發(fā)現(xiàn),BrdU陽性產(chǎn)物呈紅色斑塊狀或顆粒狀,位于細胞核內(nèi)。各組的BrdU陽性細胞均位于生精小管基膜附近的精原細胞內(nèi)。統(tǒng)計分析表明,和自然衰老組比較,青年對照組、何首烏飲組、何首烏組、肉蓯蓉組、懷牛膝組生精小管內(nèi)陽性細胞數(shù)明顯增加(P0.05);何首烏組、肉蓯蓉組、懷牛膝組陽性細胞數(shù)明顯低于何首烏飲組(P0.05),且三組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:1.青年對照組和自然衰老組共有1728個差異甲基化基因,其中238個差異甲基化基因受何首烏飲直接調(diào)控。這238個基因分布于與疾病、細胞增殖和凋亡、細胞粘附等有關(guān)的23條信號通路上。2.何首烏飲、何首烏提取液、肉蓯蓉提取液、懷牛膝提取液組均可以提高wnt2b、MAPK10和AXL的啟動子甲基化水平,下調(diào)wnt2b、MAPK10基因mRNA的表達;同時,降低Ttc29和C-myb的啟動子甲基化水平,上調(diào)Ttc29、C-myb和AXL基因m RNA的表達;其中何首烏飲的效果最好,何首烏提取液好于肉蓯蓉提取液和懷牛膝提取液。3.何首烏飲、何首烏提取液、肉蓯蓉提取液、懷牛膝提取液組均能促進自然衰老大鼠睪丸組織精原細胞的增殖,且何首烏飲組的效果強于三個單味藥組。
【學位授予單位】：河北大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R285.5

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10 孫一，

本文編號：1284314