本文關(guān)鍵詞：藥用野生稻抗逆相關(guān)基因的克隆及功能研究

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【摘要】：藥用野生稻(Oryza officinalis)攜帶多種生物和非生物脅迫的抗(耐)性基因,是水稻遺傳改良的重要基因庫(kù)。sHSP、ADF和GST基因在生物體防衛(wèi)反應(yīng)和逆境脅迫應(yīng)答中起著重要的作用。本研究從藥用野生稻(CC染色體組)干旱處理轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中篩選出3個(gè)表達(dá)差異顯著的sHSP、ADF和GST家族預(yù)測(cè)基因,分別命名為OoHsp20-3、OoADF1和OoGST1,對(duì)它們進(jìn)行基因功能探究。利用同源克隆法擴(kuò)增出目的基因完整CDS,測(cè)序結(jié)果表明,OoHsp20-3、OoADF1和OoGST1完整的ORF長(zhǎng)度分別為522bp、453bp和690bp,分別編碼173、150和229個(gè)氨基酸殘基,在藥用野生稻基因組中,Oo Hsp20-3、OoADF1和OoGST1編碼區(qū)長(zhǎng)度分別為526bp、459bp、700bp,均沒(méi)有內(nèi)含子。利用qRT-PCR技術(shù),研究了OoHsp20-3、OoADF1和OoGST1。結(jié)果顯示,OoHsp20-3、OoADF1和OoGST1在所檢測(cè)的7個(gè)組織中均表達(dá)。OoHsp20-3和OoADF1均在四葉期幼苗的根中表達(dá)量最高,而在抽穗期的葉鞘中表達(dá)量最高。Oo GST1在四葉期幼苗的葉鞘中表達(dá)量最高,抽穗期時(shí)則在葉片中表達(dá)量最高。此外還研究了OoHsp20-3、OoADF1和OoGST1分別在干旱、高溫、低溫和高鹽濃度脅迫下的表達(dá)量變化特點(diǎn)。結(jié)果表明,OoHsp20-3、OoADF1和OoGST1在高溫、干旱和高鹽濃度脅迫時(shí)表達(dá)量上調(diào)。OoHsp20-3在高溫和高鹽濃度脅迫時(shí)表達(dá)量較未處理的對(duì)照分別上調(diào)了240倍和1000倍,OoADF1在干旱和高鹽濃度脅迫時(shí)表達(dá)量較對(duì)照分別上調(diào)了17.9倍和40倍,Oo GST1在高溫和高鹽濃度脅迫時(shí)表達(dá)量較對(duì)照分別上調(diào)了3.6倍和6倍。將OoHsp20-3、Oo ADF1和OoGST1完整的CDS融合到原核表達(dá)載體pET-32a(+)或pET-28a(+),通過(guò)IPTG誘導(dǎo)及SDS-PAGE檢測(cè),結(jié)果表明這三個(gè)基因編碼的蛋白分子量分別約為14kD、16kD和23kD。OoHsp20-3在IPTG終濃度分別為1.0mM(pET-32a(+))和0.5 mM(pET-28a(+))時(shí)誘導(dǎo)蛋白表大量最大;OoADF1和OoGST1在IPTG終濃度分別為0.2mM和0.8m M時(shí)誘導(dǎo)蛋白表大量最大。細(xì)胞破碎顯示OoHsp20-3、OoADF1和OoGST1編碼的蛋白主要以包涵體的形式存在。對(duì)轉(zhuǎn)入重組子及空載體的大腸桿菌E.coli BL21(DE3)菌株分別進(jìn)行500 mM NaCl和600 mM NaCl液體和固體培養(yǎng)脅迫處理,與轉(zhuǎn)入空載體的菌株相比,均能夠更好的耐受高濃度NaCl的脅迫,表明OoHsp20-3、Oo ADF1和OoGST1對(duì)鹽脅迫有一定的響應(yīng)能力,能夠保護(hù)細(xì)胞免受高鹽的毒害。此外,液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)入重組子pET28a-OoHsp20-3的菌株在50℃脅迫條件下也表現(xiàn)出良好的耐受性。構(gòu)建了超表達(dá)載體p2300-OoHsp20-3、p2300-Oo ADF1和p2300-OoGST1,以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化日本晴,收獲OoHsp20-3轉(zhuǎn)基因株系10株和Oo ADF1轉(zhuǎn)基因株系2株,為進(jìn)一步研究藥用野生稻OoHsp20-3、OoADF1和OoGST1基因的功能奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S511.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1278963