本文關(guān)鍵詞：家蠶類胰島素多肽基因（BmILP）的特性研究

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【摘要】：胰島素和類胰島素生長因子在促進(jìn)有機(jī)體的細(xì)胞增殖、分化和生長發(fā)育等方面起到關(guān)鍵的作用。家蠶(Bombyx mori)作為一種重要的模式生物,在2003年已經(jīng)完成全基因組的測序,因此利用家蠶作為材料研究類胰島素的功能很方便。在無脊椎動(dòng)物中,最先在家蠶中鑒定到類胰島素多肽,并最終被命名為家蠶素,后在無脊椎動(dòng)物果蠅、蚊子、蝴蝶和蜜蜂中相繼鑒定到類胰島素多肽的存在。到目前為止在家蠶基因組中,共鑒定到38種家蠶素基因和1種家蠶類胰島素生長因子多肽(BIGFLP)基因,家蠶素共分為12個(gè)家族,分別是家族A-G和V-Z,其中家族A、B、C和V分別有10個(gè)、12個(gè)、6個(gè)和2個(gè)成員,而其它家族都只有1個(gè)成員。有關(guān)家蠶素的研究主要集中在基因水平上,而有關(guān)蛋白水平和家蠶體內(nèi)發(fā)揮的生理學(xué)功能的研究知之甚少。本文研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下:(1)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),BmILP基因全長4127bp,定位于家蠶基因組的1號(hào)染色體上,包括5′-UTR、3′-UTR、2個(gè)內(nèi)含子、3個(gè)外顯子和339bp的開放閱讀框(ORF),共編碼112個(gè)氨基酸,預(yù)測蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約12.6kDa,從第1個(gè)氨基酸開始的15個(gè)氨基酸預(yù)測為一段信號(hào)肽序列,且該信號(hào)肽序列的mRNA5′端會(huì)形成復(fù)雜的次級(jí)結(jié)構(gòu)。Bm ILP與家蠶素家族成員的氨基酸相似性分析發(fā)現(xiàn),BmILP與家蠶素Z1屬于同一種多肽,家蠶素B3與B12屬于同一個(gè)多肽。氨基酸保守性分析表明Bm ILP與家蠶素在進(jìn)化上非常保守,在相似的位置都存在半胱氨酸殘基,說明半胱氨酸對Bm ILP蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成至關(guān)重要。基序預(yù)測發(fā)現(xiàn)BmILP包含有兩個(gè)基序,與家蠶素家族成員同樣高度保守。(2)根據(jù)BmILP基因的ORF序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增基因片段,利用pET-30a(+)表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中,誘導(dǎo)表達(dá)全長和去信號(hào)肽BmILP基因的編碼序列,發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽對基因的表達(dá)存在很大的影響,會(huì)降低蛋白的表達(dá)量,推測是信號(hào)肽的mRNA 5′端形成的復(fù)雜次級(jí)結(jié)構(gòu)抑制了氨基酸的翻譯起始。通過對表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行純化和透析復(fù)性之后,經(jīng)質(zhì)譜鑒定和蛋白濃度的測定,免疫小鼠制備BmILP的多克隆抗體。(3)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對家蠶五齡各組織、不同發(fā)育階段的BmILP基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)相分析發(fā)現(xiàn),BmILP基因在家蠶的不同發(fā)育階段和各組織都有表達(dá),其中在卵巢的轉(zhuǎn)錄水平最高,其次是脂肪體,在頭部、絲腺、中腸、精巢和馬氏管表達(dá)量都比較低。此外在雌蛾中的轉(zhuǎn)錄水平要高于雄蛾,且在交配過的雌蛾中轉(zhuǎn)錄水平最高,表明Bm ILP可能在家蠶卵的成熟過程中是個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子。(4)通過His-tag pull down蛋白互作實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Bm ILP可能與家蠶自噬相關(guān)蛋白Atg8存在相互作用,表明Bm ILP可能參與了家蠶的免疫反應(yīng)。此外利用制備的BmILP多克隆抗體,進(jìn)行免疫沉淀(IP)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在真核細(xì)胞中BmILP多肽可能形成了多聚體,但還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。(5)利用RNA干擾技術(shù)對BmILP基因進(jìn)行干擾,經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測RNA干擾成功,發(fā)現(xiàn)BmILP基因在24h后轉(zhuǎn)錄水平開始下降,一直持續(xù)到72h,到96h的時(shí)候又恢復(fù)正常。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示從72h到96h BmILP基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平開始上升的時(shí)候,血淋巴總糖的含量在下降,但是并不會(huì)影響到體重的變化,表明BmILP能降低家蠶血淋巴中總糖的含量,因此推測Bm ILP可能參與了家蠶的糖代謝過程。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78

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