本文關(guān)鍵詞：禽致病性大腸桿菌E058株compT、pompT基因突變株的構(gòu)建及其致病性評(píng)價(jià)

  更多相關(guān)文章： APEC 突變株 compT pompT 魚(yú)精蛋白 致病性

【摘要】：禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起禽類的一種復(fù)雜的多系統(tǒng)綜合癥的總稱,其特征是多器官病變,并以氣囊炎、心包炎、肝周炎、腹膜炎最為典型。該病給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)越來(lái)越多的證據(jù)表明APEC具有人獸共患的潛能。大腸桿菌外膜蛋白T (Outer membrane protein T, OmpT)定位于大腸桿菌外膜,屬于革蘭氏陰性菌omptin外膜蛋白家族。APEC中OmpT由位于染色質(zhì)ompT基因(compT)編碼。基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)位于pAPEC-O2-ColV中的質(zhì)粒中的ompT基因(pompT)與其同源性為79%。且有研究表明：compT和pompT兩個(gè)基因在禽致病性大腸桿菌分離株中均有很高的檢出率,分別是62.5%和78.5%。關(guān)于ompT在禽大腸桿菌病發(fā)病機(jī)制中的作用還不清楚,兩個(gè)ompT是否都參與介導(dǎo)菌體侵襲及相關(guān)毒力機(jī)制還有待研究。本研究旨在探討compT和pompT基因與APEC致病性間的關(guān)系,了解APECcompT和pompT兩個(gè)基因突變株的生物學(xué)特性,為了解APEC的致病機(jī)理和尋找特異性防治措施奠定基礎(chǔ)。為了研究compT和pompT基因與APEC致病性間的關(guān)系,通過(guò)對(duì)OmpT活性部位預(yù)測(cè)分析,以APEC E058為親本株,構(gòu)建了缺失不同大小ORF的突變株和活性位點(diǎn)的點(diǎn)突變株。除了利用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好的E058△50%pormpT::cat、E058△100%pompT::cat缺失株外,本研究運(yùn)用λ RED同源重組的方法構(gòu)建了E058△50%compT::cat、 E058△100%coompT::c at缺失株。PCR擴(kuò)增帶酶切位點(diǎn)的compT基因并插入到pMD(?)19-T載體,反向擴(kuò)增pMD-T-compT片段后與cat抗性片段酶切、連接、轉(zhuǎn)化,構(gòu)建出帶Cat抗性的重組質(zhì)粒pMD-T-compT::cat。PCR擴(kuò)增同源重組片段50%compT-cat,直接用帶同源片段引物擴(kuò)增同源重組片段100%'ocompT-cat并電轉(zhuǎn)化入帶有pKD46質(zhì)粒的親本株E058中,運(yùn)用同源重組的方法,篩選出E058△50%compT::cat、E058A100%compT::cat缺失株。選擇兩個(gè)OmpT的活性相關(guān)位點(diǎn)97和99位,運(yùn)用CRISPR/Cas方法構(gòu)建了點(diǎn)突變株E058compTD97H、E058compTS99I、E058pompTD97H、E058pompTS99I。通過(guò)用E058△50%compT、E058△50%pompT無(wú)抗突變株作為親本株,構(gòu)建pTargetF-FRT重組質(zhì)粒,利用OverLap PCR擴(kuò)增引入點(diǎn)突變的同源重組片段compTD97H、compTS99I、pompTD97H、 pompTS99I,電轉(zhuǎn)化入帶有pCas質(zhì)粒的親本株中,測(cè)序篩選出E058compTD97H、 E058compTS99I、E058pompTD97H、E058pompTS99I點(diǎn)突變株。生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果顯示缺失突變株、點(diǎn)突變株和野生株E058在生長(zhǎng)速度上沒(méi)有顯著差異。魚(yú)精蛋白抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示E058△50%pompT::cat、E058△100%pompT::cat、E058pompTD97H、E058pompTS99I突變株與野生株生長(zhǎng)趨勢(shì)一致,而E058△50%compT::cat、E058△100%compT::cat、 E058compTD97H、E058compTS99I生長(zhǎng)受到抑制,說(shuō)明compT所編碼的cOmpT具有水解魚(yú)精蛋白的功能。熒光定量PCR結(jié)果顯示在E058中compT和pompT基因表達(dá)量差異不顯著。隨后我們分別將包含啟動(dòng)子區(qū)域完整ORF的compT基因序列和帶有compT啟動(dòng)子區(qū)域完整ORF的pompT基因序列插入到pACYC184質(zhì)粒,成功構(gòu)建回復(fù)株ReE058△100%compT::cat1、ReE058△100%compT::cat2,進(jìn)行魚(yú)精蛋白抑制試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)回復(fù)株都能回補(bǔ)到野生株水解魚(yú)精蛋白的水平。體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布試驗(yàn)結(jié)果表明,與野生株E058相比,突變株E058△100%compT::cat、E058△50%pompT::cat毒力均顯著致弱,而突變株E058△50%compT::cat、E058△100%pompT::cat并未表現(xiàn)致弱。進(jìn)一步通過(guò)熒光定量PCR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)毒力相關(guān)基因iucD和fimC在E058△50%compT::cat表達(dá)量均顯著高于E058△100%compT::cat。LD50試驗(yàn)結(jié)果顯示,有抗突變株E058△50%pompT::cat較野生株E058致病性下降10倍,無(wú)抗突變株E058△50%pompT致病性并沒(méi)有下降。針對(duì)這一現(xiàn)象,我們將帶有pompT啟動(dòng)子區(qū)域50%pompT-FRT基因序列插入到pACYC184質(zhì)粒,獲得回復(fù)株ReE058△50%pompT::cat,但其LDso結(jié)果顯示并沒(méi)有回補(bǔ)到野生株水平；突變株E058△50%compT::cat、E058△100%pompT::cat致病性沒(méi)有減弱,E058△100%pompT::cat較野生株E058致病性下降10倍與體內(nèi)定居實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。血清殺菌試驗(yàn)結(jié)果表明各突變株、回復(fù)株與野生株對(duì)SPF雞血清殺菌作用不敏感。上述結(jié)果表明,相對(duì)于染色質(zhì)OmpT (cOmpT),質(zhì)粒OmpT (pOmpT)在生物學(xué)特性、對(duì)APEC的致病性等方面,具有其特殊性,表現(xiàn)在：(1)pOmpT不能水解魚(yú)精蛋白；(2)敲除其50%片段,突變株的致病性顯著下降,而敲除其整個(gè)閱讀框,突變株的致病性反而不下降。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張文東,王永賢;致病性奇異變形桿菌的分離與鑒定[J];云南畜牧獸醫(yī);2000年02期

2 匡存林,陳宏軍,肖文華;雞源致病性大腸埃希氏菌致病性及抗生素敏感性試驗(yàn)[J];動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué);2004年12期

3 ;高致病性動(dòng)物病原微生物菌(毒)種或者樣本運(yùn)輸包裝規(guī)范[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2005年07期

4 ;高致病性動(dòng)物病原微生物菌(毒)種或者樣本運(yùn)輸包裝規(guī)范[J];中國(guó)動(dòng)物檢疫;2005年07期

5 ;高致病性動(dòng)物病原微生物菌(毒)種或者樣本運(yùn)輸包裝規(guī)范[J];湖南畜牧獸醫(yī);2005年06期

6 劉永宏;林健;趙麗;韓春華;王鳳龍;劉月煥;;4株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離和鑒定[J];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2013年01期

7 杜銀中;葡萄球菌五項(xiàng)致病性指標(biāo)相關(guān)性的研究[J];畜禽業(yè);2000年04期

8 侯麗麗;趙鐵柱;遇秀玲;曹振;鄧小雨;喬明明;張碩;王斌;陳西釗;田克恭;;高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒分子流行病學(xué)調(diào)查[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2009年06期

9 羅明典;;質(zhì)體(質(zhì)粒)國(guó)際會(huì)議——細(xì)菌質(zhì)體分子生物學(xué)、致病性和生態(tài)學(xué)[J];遺傳工程;1981年02期

10 ;高致病性動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理審批辦法[J];河北畜牧獸醫(yī);2005年07期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 肖一紅;馬利宏;李曉靜;邱洪凱;劉岳;于穎;劉寧寧;周恩民;;山東省高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離與鑒定[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)病理學(xué)分會(huì)第十六次學(xué)術(shù)研討會(huì)、中國(guó)病理生理學(xué)會(huì)動(dòng)物病理生理專業(yè)委員會(huì)第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

2 郭亞輝;郭堅(jiān)華;;水稻條斑病菌保藏13年的致病性檢驗(yàn)[A];中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2005年學(xué)術(shù)年會(huì)暨植物病理學(xué)報(bào)創(chuàng)刊50周年紀(jì)念會(huì)論文摘要集[C];2005年

3 郭亞輝;郭堅(jiān)華;;水稻條斑病菌保藏13年的致病性檢驗(yàn)[A];中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2005年學(xué)術(shù)年會(huì)暨植物病理學(xué)報(bào)創(chuàng)刊50周年紀(jì)念會(huì)論文集[C];2005年

4 陳仕龍;黃梅清;林天龍;江斌;莊向生;陳少鶯;;應(yīng)用單抗鑒別高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第三屆豬病防控學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

5 肖燕;安同慶;田志軍;韋天超;姜一峰;周艷君;彭金美;仇華吉;童光志;;高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染后豬肺泡巨噬細(xì)胞的差異轉(zhuǎn)錄基因文庫(kù)的構(gòu)建[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會(huì)暨中國(guó)免疫學(xué)會(huì)獸醫(yī)免疫分會(huì)第七次研討會(huì)論文集[C];2008年

6 周盛華;崔尚金;張超范;謝紅玲;陳長(zhǎng)木;苗嵐飛;;抗高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備與鑒定[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第三屆豬病防控學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

7 程旭;沈欣悅;劉加圣;劉梅;徐玲霞;韋玉勇;周生;戴亞斌;;鴨源坦布蘇病毒對(duì)不同禽種的致病性初步觀察[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十六次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2012年

8 張志凌;閆若潛;趙明軍;劉光輝;趙雪麗;盛敏;吳志明;;豬α干擾素的原核表達(dá)及抗高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒活性測(cè)定[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第三屆豬病防控學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

9 鄭杰;寧宜寶;劉業(yè)兵;邱立新;;高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的診斷與防制[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第三屆豬病防控學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

10 趙明軍;吳志明;閆若潛;王東方;趙雪麗;劉梅芬;;鑒別高、低致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒二重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第八屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2013年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 記者鄭靈巧;“甲流”病毒遺傳學(xué)特征為低致病性[N];健康報(bào);2009年

2 陳艷玲;科區(qū)全力部署高致病性禽流感防控工作[N];通遼日?qǐng)?bào);2005年

3 ;高致病性豬藍(lán)耳病活疫苗使用方法及注意事項(xiàng)[N];江蘇農(nóng)業(yè)科技報(bào);2009年

4 山西恒豐強(qiáng)動(dòng)物藥業(yè)有限公司廣州公司 高懷濤;高致病性豬藍(lán)耳病的防控[N];中國(guó)畜牧獸醫(yī)報(bào);2007年

5 本報(bào)記者 鄧小敏;落實(shí)高致病性禽流感防控措施[N];韶關(guān)日?qǐng)?bào);2005年

6 記者 趙宇青邋通訊員 陳偉華;6項(xiàng)成果達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平[N];珠海特區(qū)報(bào);2007年

7 記者 董明 通訊員 胡天富;農(nóng)林不減產(chǎn) 養(yǎng)殖再發(fā)展[N];柳州日?qǐng)?bào);2008年

8 記者 張會(huì)斌;全省生豬生產(chǎn)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展[N];遼寧日?qǐng)?bào);2007年

9 陳堅(jiān)邋廖太林;當(dāng)危機(jī)突然降臨……[N];中國(guó)國(guó)門時(shí)報(bào);2008年

10 記者 邱銳;一手抓防控 一手抓發(fā)展[N];廣元日?qǐng)?bào);2006年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張龍;PRRSV 感染影響 Th17 細(xì)胞應(yīng)答與 IL-17A 對(duì) PRRSV 復(fù)制的抑制效應(yīng)分析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 徐鳳琴;高致病性PRRSV雙抗夾心ELISA抗原檢測(cè)試劑盒的研制及基因工程疫苗的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

3 姜一峰;高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒強(qiáng)弱毒毒力差異的分子基礎(chǔ)研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

4 韓鐵鎖;SSM-CVB3感染獼猴模型的建立及其致病性的研究[D];吉林大學(xué);2012年

5 何青;PRRSV不同致病性毒株非結(jié)構(gòu)蛋白誘導(dǎo)靶細(xì)胞細(xì)胞因子差異表達(dá)的分子基礎(chǔ)[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

6 王剛;高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒HuN4株感染所致的免疫損傷及免疫調(diào)控機(jī)理[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

7 劉永宏;高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病理學(xué)研究及其病毒的序列分析[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

8 趙巖;Ⅳ型分泌系統(tǒng)在高致病性2型豬鏈球菌引發(fā)鏈球菌中毒性休克綜合征中作用的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2011年

9 胡守萍;高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒致弱效果的免疫病理學(xué)和分子病理學(xué)評(píng)價(jià)[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

10 Abebe Jenberie Wubie;蜜蜂球囊菌遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建及其致病性的分子機(jī)理研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王迪;外源低濃度NO和H_2O_2對(duì)Alternaria alternata致病性的影響及其機(jī)理研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 元雪湞;qseC基因缺失對(duì)雞致病性大腸桿菌致病性的影響[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

3 陳娟;禽致病性大腸桿菌E058株compT、pompT基因突變株的構(gòu)建及其致病性評(píng)價(jià)[D];揚(yáng)州大學(xué);2016年

4 林海云;青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）致病性差異及其相關(guān)基因的分析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2012年

5 梅建國(guó);應(yīng)用生物反應(yīng)器生產(chǎn)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原的技術(shù)工藝研究[D];吉林大學(xué);2012年

6 郭楊;熒光定量RT-PCR檢測(cè)高致病性PRRSV方法的建立[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

7 魏津;高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（JXA1-R株）國(guó)家參考品的研制及定值方法的建立[D];中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;2013年

8 宮大慶;高致病性PRRSV HuN4株感染仔豬過(guò)程中淋巴結(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2011年

9 李秀云;雞新城疫吉林強(qiáng)毒株的分離及其致病性的研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

10 張海江;高致病性PRRSV WUH3株分離鑒定及體外傳代的遺傳變異研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

，

本文編號(hào)：1242116