本文關(guān)鍵詞：豬Sox6的基因克隆、原核表達(dá)及其在調(diào)控肌纖維類型轉(zhuǎn)化中的作用

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【摘要】：由于傳統(tǒng)的飲食習(xí)慣,豬肉成為世界消費量最大的肉產(chǎn)品。隨著國家經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人們的生活水平越來越高,消費者對豬肉品質(zhì)的要求也越來越高。而豬肉品質(zhì)與肌纖維類型密切相關(guān)。根據(jù)肌球蛋白(MyHC)亞型,肌纖維可分為Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx和Ⅱb型,分別以表達(dá)MyHC Ⅰ、MyHC Ⅱa MyHC Ⅱx和MyHC Ⅱb為主。提高Ⅰ型肌纖維在肌肉中的比例可有效地改善豬肉品質(zhì)。Sox6是轉(zhuǎn)錄因子Sox基因家族的重要成員,參與肌纖維類型轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié),影響肌肉中Ⅰ型肌纖維的比例。因此,Sox6在豬肉品質(zhì)調(diào)控方面有潛在的應(yīng)用。但有關(guān)豬Sox6的研究目前在國內(nèi)外尚未見報道。本研究旨在克隆豬Sox6基因,構(gòu)建豬Sox6原核和真核表達(dá)載體,制備重組豬Sox6蛋白,考察過表達(dá)豬Sox6和外源添加重組豬Sox6蛋白對肌纖維類型轉(zhuǎn)化的影響。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：試驗一豬Sox6基因編碼區(qū)全序列克隆及組織表達(dá)規(guī)律分析Sox6屬于轉(zhuǎn)錄因子Sox基因家族的一員,參與肌纖維類型轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié),是慢肌特異基因的抑制子,影響肌肉中Ⅰ型肌纖維的含量。但豬Sox6基因序列目前尚不清楚。為此,本研究以3日齡DLY (DurocxLandracexYorkshire)仔豬為試驗材料,取500mmg背最長肌用于總RNA提取并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)已知的小鼠、大鼠和人的Sox6編碼區(qū)序列,設(shè)計一對簡并引物用于擴(kuò)增豬Sox6基因目的片段。DNA測序結(jié)果顯示,豬Sox6基因編碼區(qū)全序列大小為2406bp,編碼801個氨基酸。將該序列提交至GenBank,獲得的序列登錄號為KF933861。序列分析結(jié)果表明,豬Sox6基因核苷酸序列與已知的人、小鼠、大鼠和牛的Sox6基因核苷酸序列同源性分別為87.7%、86.71%、90.91%、89.49%。序列分析結(jié)果同時表明,豬Sox6蛋白的氨基酸序列與已知的人、小鼠、大鼠和牛的Sox6蛋白的氨基酸序列同源性分別為89.9%、90.74%、95.26%、90.53%,含有Sox6蛋白保守(100%同源)的HMG box、N端和C端的Q-box、亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu),暗示豬Sox6可能具有與已報道的其他物種Sox6相類似的功能。接下來,以10周齡DLY豬(母)為研究對象,采用實時熒光定量PCR檢測豬Sox6基因在心、肝、腎、脂肪、背最長肌、趾長伸肌、比目魚肌、腰大肌、脛骨前肌組織中的表達(dá)水平。結(jié)果表明,豬Sox6 mRNA在豬心臟和骨骼肌中表達(dá)最豐富,在腎臟、脂肪、肝臟、脾臟和肺組織中也可檢測到,且在不同類型骨骼肌組織中存在表達(dá)差異(背最長肌趾長伸肌比目魚肌)試驗二豬Sox6基因在大腸桿菌中的表達(dá)和純化以pET-30a(+)為載體,成功構(gòu)建了用于表達(dá)C端融合6 X His-Tag的重組豬Sox6的原核表達(dá)載體pET-30a(+)-pSox6。以大腸桿菌Rosetta (DE3)為宿主菌,實現(xiàn)了豬Sox6基因的表達(dá),目的蛋白分子量約為90 kDa。為獲得最佳蛋白表達(dá)條件,分別設(shè)置了0mmol/L、0.25 mmol/L、0.5mmol/L、0.75 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、3.0 mmol/LIPTG誘導(dǎo)濃度和分別設(shè)置了1h、3h、4h、5h、6h、8h表達(dá)時間點,SDS-PAGE結(jié)果表明,重組蛋白最佳表達(dá)條件為在30℃下用1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5h。溶解性分析結(jié)果表明,重組蛋白以可溶性方式存在。表達(dá)產(chǎn)物采用親和層析法進(jìn)行純化,最終重組蛋白濃度約為5μg/mL。對純化后的重組蛋白進(jìn)行Western blot和蛋白質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF)鑒定,結(jié)果表明,純化的重組蛋白為豬Sox6蛋白。試驗三豬Sox6在調(diào)控肌纖維類型轉(zhuǎn)化中的作用在成功構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-pSox6、獲得重組豬Sox6蛋白和分離原代豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的基礎(chǔ)上,本研究考察了豬Sox6對肌纖維類型轉(zhuǎn)化的影響。首先,采用肌肉注射方法將pcDNA3.1(+)-pSox6質(zhì)粒注射到小鼠脛骨前肌中,在動物水平探討過表達(dá)豬Sox6對MyHC各亞型表達(dá)的影響。實時熒光定量PCR結(jié)果表明,過表達(dá)豬Sox6顯著下調(diào)了MyHC Ⅰ mRNA的表達(dá),同時顯著上調(diào)了 MyHC Ⅱa、MyHC Ⅱx和MyHC Ⅱb mRNA的表達(dá)。Western Blot結(jié)果表明,過表達(dá)豬Sox6下調(diào)了MyHC Ⅰ蛋白的表達(dá),同時上調(diào)了MyHC Ⅱb蛋白的表達(dá)。其次,以C2C12細(xì)胞為對象,從體外水平探討了過表達(dá)豬Sox6對MyHC Ⅰ和MyHC Ⅱb蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果表明,過表達(dá)豬Sox6下調(diào)了C2C12細(xì)胞中MyHC Ⅰ蛋白的表達(dá),同時上調(diào)了C2C12細(xì)胞中MyHC Ⅱb蛋白的表達(dá)。最后,在體外水平探討了外源添加重組豬Sox6蛋白對原代豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中慢肌纖維相關(guān)基因表達(dá)的影響,結(jié)果表明,外源添加重組豬Sox6蛋白顯著下調(diào)了豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中MyHC I、Tnnt1、Tnnc1、Tnni1 mRNA的表達(dá)。上述結(jié)果表明,豬Sox6在調(diào)控肌纖維類型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要的作用�？傊�,本研究成功克隆了豬Sox6基因編碼區(qū)全序列并發(fā)現(xiàn)其主要表達(dá)于豬心臟和骨骼肌中,首次用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、親和層析純化以及稀釋復(fù)性的方法獲得了具有生物學(xué)活性的重組豬Sox6蛋白,證實了豬Sox6在調(diào)控肌纖維類型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要的作用。本研究結(jié)果填補(bǔ)了豬Sox6基因的空白,同時為改善豬肉品質(zhì)提供了重要理論依據(jù)和新的思路。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S828

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