本文關(guān)鍵詞：hISO基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá)及鑒定

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【摘要】：目的:構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a(+)-hISO,探討其融合蛋白在大腸桿菌中的穩(wěn)定表達(dá)情況,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。方法:以Caco-2細(xì)胞的總RNA為模版,采用RT-PCR方法擴(kuò)增出大小為1 770bp的人異麥芽糖酶(hISO)基因片段,將其插入到pET-28a(+)中,構(gòu)建重組載體pET-28a(+)-hISO。經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序鑒定后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá),親和層析純化重組蛋白,利用SDS-PAGE電泳、Western blotting對(duì)重組蛋白進(jìn)行分析和鑒定。結(jié)果:經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序鑒定后,重組質(zhì)粒pET-28a(+)-hISO構(gòu)建正確,表達(dá)重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為68 860,將融合蛋白進(jìn)行純化,經(jīng)40和60mmol·L-1咪唑緩沖液洗脫后能夠得到濃度和純度相對(duì)較高的蛋白。結(jié)論:成功地構(gòu)建了hISO基因的原核表達(dá)載體,并在大腸桿菌中獲得了融合蛋白表達(dá)。
【作者單位】： 遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生物化學(xué)教研室;遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室;
【基金】：貴州省科技廳社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目資助課題[黔科合SY字(2012)3091)] 遵義醫(yī)學(xué)院青年科研啟動(dòng)基金資助課題(F-501)
【分類(lèi)號(hào)】：Q78;R378.21
【正文快照】： 糖酶(sucrase-isomaltase,SI)復(fù)合體均屬于α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase),人體當(dāng)中的這4種α-葡萄糖苷酶均具有水解α-1,4糖苷鍵的作用,其中SI復(fù)合體的N端還具有水解α-1,6糖苷鍵的作用,SI復(fù)合體在腸道中的胰蛋白酶的作用下分解為蔗糖酶和異麥芽糖酶(isomaltase,ISO)而發(fā)揮作

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