本文關(guān)鍵詞：青海弧菌熒光素酶基因異源表達(dá)優(yōu)化及其轉(zhuǎn)座載體構(gòu)建

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【摘要】：熒光素酶是發(fā)光菌在生物發(fā)光過程中起催化作用的關(guān)鍵因子,由還原性黃素單核甘酸(FMNH2)、氧氣、脂肪醛發(fā)生生化反應(yīng),生成脂肪酸、水和490 nm的藍(lán)綠光。當(dāng)前成像技術(shù)和以熒光素酶為基礎(chǔ)的生物發(fā)光菌株結(jié)合的方法提供了一個(gè)靈敏、簡單而且非致病性的檢測(cè)手段,熒光素酶的研究成為科研工作中的一個(gè)熱點(diǎn)。生物發(fā)光標(biāo)記以其可視化、便捷、快速、靈敏,可用于活體研究等諸多優(yōu)點(diǎn)越來越多地應(yīng)用于科學(xué)研究中。本次研究對(duì)構(gòu)建成功的帶有青�；【鸁晒馑孛富騦uxAB的重組質(zhì)粒大腸桿菌Top10表達(dá)條件優(yōu)化,為進(jìn)一步在益生菌等食品微生物中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),而且為后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)的研究和酶的分子修飾提供參考。試驗(yàn)后半部分構(gòu)建的帶有青�；【鸁晒馑孛富騦uxAB的轉(zhuǎn)座載體的重組菌株Z10,利用轉(zhuǎn)座發(fā)生后熒光素酶可以穩(wěn)定高效表達(dá)這一特點(diǎn),為發(fā)光菌對(duì)環(huán)境、食品等領(lǐng)域的檢測(cè)提供了一個(gè)原始材料。具體研究結(jié)果如下:(1)核酸電泳驗(yàn)證和蛋白表達(dá)驗(yàn)證表明,重組質(zhì)粒已經(jīng)導(dǎo)入大腸桿菌并且熒光素酶已經(jīng)表達(dá)。(2)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化結(jié)果,單因素結(jié)果表明:培養(yǎng)基初始pH為6.0,癸醛終濃度為1.25‰(v/v),接種量為1%,IPTG濃度為0.1 mmol/L,裝液量為50 mL/150mL,溫度為37℃重組菌的發(fā)光度最大,即熒光素酶表達(dá)量最大。(3)正交試驗(yàn)表明:構(gòu)建的重組發(fā)光性細(xì)菌發(fā)光影響程度從大到小依次是接種量、溫度、初始pH、IPTG誘導(dǎo)濃度,而且pH為6.0,IPTG濃度為0.08 mmol/L,接種量為1.2%,溫度為36℃表達(dá)情況最好,發(fā)光度達(dá)到1262.7,并且正交試驗(yàn)結(jié)果與單因素最優(yōu)組合結(jié)果相比,發(fā)光強(qiáng)度更大,說明正交試驗(yàn)的條件是熒光素酶表達(dá)的最優(yōu)條件。(4)轉(zhuǎn)座載體的酶切驗(yàn)證和測(cè)序表明,已經(jīng)成功構(gòu)建帶有青�；【鸁晒馑孛富虻霓D(zhuǎn)座載體,并將其保存于大腸桿菌Top10。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TS201.3

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1 李t，

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