本文關(guān)鍵詞：黃色花形成機(jī)制及基因工程研究進(jìn)展，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

第 45 卷 第 2 期 2009年 2 月

林
SCIENTIA

業(yè)

科
SILVAE

學(xué)
SINICAE

黃色花形成機(jī)制及基因工程研究進(jìn)展
周　 　 　 　 琳 王 雁 彭鎮(zhèn)華
( 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 國(guó)家林

業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 　 北京 100091)

摘　 :　 要 通過對(duì)黃色花的花色素組成及其主要花色素生物合成途徑中相關(guān)酶和基因的介紹 ,綜述黃色花形成的 生物化學(xué)及分子生物學(xué)機(jī)制研究進(jìn)展 ,并分析利用基因工程技術(shù) ,通過抑制花色苷合成途徑中關(guān)鍵酶的基因表達(dá) 討黃色花卉基因工程研究中存在的主要問題和應(yīng)用前景 。 關(guān)鍵詞 : 　 黃色花 ; 形成機(jī)制 ; 基因工程 中圖分類號(hào) :S718146 　　　 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 :A 　　　 文章編號(hào) :1001 - 7488 (2009) 02 - 0111 - 09

或?qū)胪庠袋S色花形成相關(guān)基因 ,獲得黃色花卉新品種的可行性 , 以期為開展黃色花分子育種提供參考 。同時(shí)探

Advances in Study on Formation Mechanism and Genetic Engineering of Yellow Flowers
Zhou Lin 　 Wang Yan 　 Peng Zhenhua
( Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation of State Forestry Administration 　Research Institute of Forestry , CA F 　Beijing 100091)

Abstract : 　 This paper introduced flower pigments composition , and related enzymes and genes involved in the main pigments biosynthetic pathway in yellow flowers , and reviewed the advances in study on the biochemical and molecular biological mechanism of yellow flowers’ formation are summarized ,and analyzed the feasibility of using genetic engineering to breed yellow flower plants. The main pathways include inhibiting the gene expression of the key enzymes of anthocyanin biosynthesis or introducing some exotic related genes about yellow flower generation. This review intended to offer the reference on yellow flower molecular breeding. Finally , main problems and perspectives about the research of yellow flower genetic engineering were discussed. Key words : 　 yellow flower ; formation mechanism ; genetic engineering

　　 花色的優(yōu)劣直接關(guān)系到觀賞植物的觀賞價(jià)值和

利用基因工程技術(shù)能夠擴(kuò)大植物基因庫(kù) 、 定向修飾 等特點(diǎn)開展花色分子育種已成為花卉基因工程研究 的重點(diǎn) ( Tanaka et al . ,1998 ; 2005) 。其中 ,藍(lán)色花形 成機(jī)制和轉(zhuǎn)基因育種研究得最為深入 , 并取得了一 系 列 令 人 矚 目 的 成 果 ( Brugliera et al . , 2000 ;
Katsumoto et al . ,2007) 。

商業(yè)價(jià)值 ,是觀賞植物最重要的質(zhì)量指標(biāo)之一 。因

此 ,培育具有新型花色的花卉新品種一直是觀賞植 物育種領(lǐng)域的研究熱點(diǎn) (Mol et al . ,1999) 。長(zhǎng)期以 來 ,傳統(tǒng)雜交育種和定向選擇育種在花色改良中做 出了重要貢獻(xiàn) ,但傳統(tǒng)育種難以打破植物生殖隔離 ,

造成一些重要的觀賞植物仍然欠缺某些花色品系 , 如天竺葵 ( Pelargonium graveolens ) 、 仙客來 ( Cyclamen
persicum ) 、 翠菊 ( Callistephus chinensis ) 等缺乏純黃色 ,

色彩鮮艷的黃色花以其能夠給人以活力 、 明朗

和高貴的感覺而受到廣泛喜愛 。針對(duì)一些重要觀賞 植物欠缺黃色品系的問題 , 近年來育種工作者對(duì)黃 色花的形成機(jī)制也進(jìn)行了不斷探索 , 為實(shí)現(xiàn)黃色花 分子育種提供了有益的借鑒 。然而 , 盡管有關(guān)花色 形成機(jī)制及其基因工程改良的綜述有很多 ( 于曉南 等 ,2002 ; Tanaka et al . ,2005 ; 2008a) ,但目前針對(duì)黃 色花研究進(jìn)展的綜述還未見發(fā)表 。本文根據(jù)前人的 研究 ,就黃色花形成的化學(xué)基礎(chǔ) 、 黃色花色素的生物 合成途徑以及相應(yīng)的分子育種思路進(jìn)行了闡述 , 并 探討了存在的問題及發(fā)展前景 , 以期為今后黃色花

月季 ( Rosa chinensis ) 、 香石竹 ( Dianthus caryophyllus ) 、 菊花 ( Dendranthema morifolium ) 等缺少藍(lán)色和紫色 , 球根鳶尾 ( Iris xiphium ) 、 紫羅蘭 ( Matthiola incana ) 等 缺乏猩紅色或磚紅色 ( 彭鎮(zhèn)華等 ,2001) 。

近年來 ,隨著花色形成機(jī)制研究的不斷深入 ,參

與花色形成的色素生物合成途徑中很多相關(guān)酶和基 因 相 繼 被 分 離 和 克 隆 ( Springob et al . , 2003 ;
Grotewold ,2006 ; Tanaka et al . ,2008b) 。在此基礎(chǔ)上 ,
收稿日期 :2008 - 02 - 27 。 3 王雁為通訊作者 。

基金項(xiàng)目 “十一五” : 國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863 計(jì)劃) 項(xiàng)目 (2006AA100109) ; 國(guó)家林業(yè)局 948” “ 項(xiàng)目 (2006 - 4 - C07) 資助 。

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Vol145 ,No12 Feb. ,2 0 0 9

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基因工程改良提供理論依據(jù) 。

1　 黃色花的花色素組成
決定 花 色 的 化 學(xué) 物 質(zhì) 主 要 包 括 類 黃 酮 (flavonoids) 、 胡 蘿 卜 素 ( carotenoids ) 和 甜 菜 色 素 類 ( betalains) 三類 。類黃酮是大多數(shù)花色形成的決定 性色素群 ( 黃金霞等 ,2006) ,存在于花瓣表皮細(xì)胞液 泡中 ,除花色素苷 ( anthocyanin) 屬紅色系 , 控制花的 粉紅 、 、 、 紅 藍(lán) 紫和紫紅色外 , 其他均屬黃色系 , 其中 查耳 酮 ( chalcone ) 和 噢 　 ( aurone ) 為 深 黃 色 , 黃 酮 (flavone) 、 黃酮醇 (flavonol ) 、 黃烷酮 (flavanone ) 等為 淡黃 色 或 接 近 無 色 ; 類 胡 蘿 卜 素 是 胡 蘿 卜 素 (carotene) 和葉黃素 ( xanthophylls) 的統(tǒng)稱 , 存在于質(zhì) 體內(nèi) ,廣泛分布在植物的花 、 、 葉 根和果皮等部位 ,使 其呈現(xiàn)黃色 、 橙色或紅色 ; 甜菜色素是由酪氨酸衍 生而來的含氮化合物 , 它是三大色素群中含量最少 的一類 ,由 ( 深) 紅色的甜菜紅素 ( betacyanins) 和黃色 的甜菜黃素 ( betaxanthins) 組成 ,參與花瓣黃色 、 橙色 及紅色的形成 ,僅存在于除粟米草科 (Molluginaceae) 和石竹科 ( Dianthus) 以外的石竹目 ( Caryophyllales) 的 一些 植 物 中 , 如 莧 科 ( Amaranthaceae ) 、 茉 莉 科 紫 (Nyctaginaceae) 、 商陸科 ( Phytolaccaceae ) 等 ( Strack et al . ,2003) 。 廣義的黃色花根據(jù)其顏色深淺的不同 , 從接近 白色的淺黃到鮮艷的深黃可以分為多種花色 。其 中 ,肉眼難以辨別的幾乎為白色的淺黃色花 ,如白薔 薇花 ( Rosa spp . ) 、 白菊花等色素構(gòu)成非常簡(jiǎn)單 , 只 含淺黃色或接近無色的類黃酮 ,如黃酮 、 黃酮醇等這 一類色素 ; 而肉眼能夠感知的黃色花色素組成相對(duì) 比較復(fù)雜 ,主要與類黃酮和類胡蘿卜素兩大色素類 群有關(guān) ,并根據(jù)植物種類的不同 ,有的只含類黃酮或 類胡蘿卜素其中一類 ,如郁金香 ( Tulipa gesneriana ) 、 向日葵 ( Helianthus annuus ) 等 ; 有的則是類黃酮和類 胡蘿卜素兩者并存 , 如萬壽菊 ( Tagetes erecta ) 、 酢醬 草 ( Oxalis corniculata ) 等等 ( 安田 齊 ,1989) 。另外 ,甜 菜 黃 素 在 雞 冠 花 ( Celosia cristata ) 、 齒 莧 屬 馬 ( Portulaca ) 、 葉子花屬 ( Bougainvillea ) 等植物的黃色 花形 成 中 起 了 主 要 作 用 ( Toyama et al . , 1992 ; Schliemann et al . ,2001 ; Kugler et al . ,2007) 。 從圖 1 可以看出 , 呈黃色的類黃酮類化合物主 要有查耳酮和噢　兩類 ( Tanaka et al . ,2005) 。其中 2′ 4′ 6′ 4 - 四 羥 基 查 耳 酮 ( 2′ 4′ 6′ 4 , , , , , , tetrapydroxychalcone ,THC) 容易在查耳酮異構(gòu)酶或自 發(fā)異構(gòu)的作用下形成無色的柚皮素 ( naringenin) , 因 此 ,它往往以 2′ 糖苷即異杞柳苷 ( isosalipurposide , -

ISP) 的形式穩(wěn)定存在于液泡中 ,構(gòu)成香石竹 、 金蓮牡 丹 ( Paeonia potaninii var. trollioides ) 、 春 花 屬 長(zhǎng) ( Catharanthus ) 等 植 物 黃 色 花 瓣 中 的 主 要 色 素 ( Harborne ,1966 ; Y oshida et al . ,2004) ; 另外 ,還發(fā)現(xiàn)

了其他幾種分布較為集中的黃色查耳酮糖苷 , 如菊 科植物中的 6′ 脫氧查耳酮 ( 6′ deoxychalcones) 和 紅 花 ( Carthamus tinctorius ) 中 的 紅 花 黃 色 素 A ( safflomin A) 等 ( Tanaka et al . ,2005 ; 2008b) 。噢　 比查耳酮類色素呈現(xiàn)更鮮艷的黃色 , 但能夠積累噢 的植物比較有限 ,主要分布在菊科 (Asteraceae) 、 玄 ( Scrophulariaceae) 和補(bǔ)血草屬 ( Limonium ) 中 , 如 參科 金 魚 草 ( Antirrhinum majus ) 和 波 斯 菊 ( Cosmos
bipinnatus ) 等 , 此外一些苔類植物中也有噢　合成

(Nakayama ,2002) 。

在含有類胡蘿卜素的黃色花瓣中起主要作用的 是葉黃素類化合物 ( Tanaka et al . ,2008b) 。它是在 橙黃色的胡蘿卜素分子中引入羥基 、 甲氧基及酯鍵 等轉(zhuǎn) 化 成 的 一 類 含 氧 衍 生 物 , 常 見 的 有 隱 黃 質(zhì) ( cryptoxanthin ) 、 米 黃 質(zhì) ( zeaxanthin ) 、 黃 素 玉 葉 ( lutein ) 、堇 菜 黃 質(zhì) ( violaxanthin ) 和 新 黃 質(zhì) ( neoxanthin) 等 。通常 , 這類植物花瓣黃色的深淺與 其積 累 的 葉 黃 素 的 種 類 和 含 量 有 關(guān) 。宮 燈 百 合 ( Sandersonia aurantiaca ) 金黃色花瓣中主要為隱黃質(zhì) 和玉米黃質(zhì) (Nielsen et al . ,2003) ; 金盞菊 ( Calendula
officinalis ) 中主要為毛茛黃素 (flavoxanthin) 和金黃質(zhì)

( auroxanthin) (Bakóet al . ,2002) ; 旱金蓮 ( Tropaeolum majus ) 中以葉黃素為主 , 另外還含有少量的堇菜黃

質(zhì)和玉米黃質(zhì) (Niizu et al . ,2005) ; 萬壽菊 (Moehs et al . ,2001) 和菊花 ( Kishimoto et al . ,2004) 黃色花瓣中 90 %以上的類胡蘿卜素為葉黃素及其衍生物 , 且萬 壽菊中葉黃素含量的不同是使其花色由白色到深橙 色變異的主要原因 ( Khachik et al . ,1999) 。

2　 黃色花花色素的生物合成及其基因
目前 ,除甜菜色素外 ,類黃酮和類胡蘿卜素類色 素的生物合成途徑都已基本明確 ( 圖 1 、 2 , Tanaka 圖 et al . , 2008b ) , 相關(guān)酶和基因的研究也非 常 深 入 ( Springob et al . ,2003 ; Tanaka et al . ,2008b ) 。本文 中主要針對(duì)上述在黃色花呈色中起重要作用的花色 素生物合成相關(guān)酶和基因進(jìn)行闡述 。
211 　 查耳酮及其糖苷生物合成相關(guān)酶及基因 21111 　 查耳酮合酶 　 在類黃酮生物合成途徑中 ( 圖 1) ,查耳酮合酶 ( chalcone synthase ,CHS) 催化 1 個(gè)分

子的香豆酰 CoA 與 3 個(gè)分子的丙二酰 CoA 縮合形 成黃色的四羥基查耳酮 THC 。THC 為類黃酮類化合

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物提供了基本碳骨架 , 是一個(gè)重要的中間產(chǎn)物 。因 此 ,CHS 作為生物合成途徑中的限速酶和關(guān)鍵酶 ,已 從多種植物中分離 、 純化 ,相應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)也已明確 ( Ferrer et al . ,1999) 。 CHS 是類黃酮合成途徑中第一個(gè)被分離的基 因 ,最早是從歐芹 ( Petroselinum hortense ) 懸浮細(xì)胞中 得 到 的 ( Kreuzaler et al . , 1983 ) 。此 后 , 豆 科
(Leguminosae ) 、 字 花 科 ( Brassicaceae ) 、 花 科 十 旋 ( Convolvulaceae) 等多種植物的 CHS 相繼被克隆 。序

max) 、 牽 牛 、 草 ( Nicotiana tabacum ) 等 植 物 的 矮 煙 CHI 也已被克隆 (Li et al . ,2006 ) 。研究表明 , 矮牽

�；蚪M中存在 2 個(gè) CHI , CHIA 在花組織和經(jīng)紫外 線照射的幼苗中表達(dá) , CHIB 僅在未成熟的花粉中表 達(dá) ( van Tunen et al . ,1989) ; 過表達(dá)矮牽牛 CHIA 可 以提高番茄 ( Lycopersicon esculentum ) 果實(shí)中黃酮醇的 含量 ( Muir et al . , 2001 ) ; 導(dǎo) 入 反 義 水 母 雪 蓮
( Saussurea medusa ) CHI 可抑制煙草中類黃酮的合成 (Li et al . ,2006) 。目前 , CHI 表達(dá)分析和調(diào)控機(jī)制

列同源性分析發(fā)現(xiàn) , CHS 編碼區(qū)保守性很強(qiáng) , 不同 科植物間核苷酸水平上的同源性超過 60 % , 氨基酸 水平上的同源性達(dá) 80 % , 可以用于研究基因進(jìn)化 (王金玲等 , 2000 ) 。 Yang 等 ( 2003 ) 通 過 對(duì) 山 茶 屬 ( Camellia ) 植物 CHS 外顯 子 2 序 列 的 分 析 , 認(rèn) 為
CHS 基因家族在進(jìn)化過程中已分化為 3 個(gè)亞家族 。

的研究相對(duì)不足 , 在花色基因工程改良中有關(guān) CHI 轉(zhuǎn)基因的報(bào)道也很少 (Nishihara et al . ,2005) 。
21113 　 查耳酮 2′ 葡糖基轉(zhuǎn)移酶 　 如圖 1 所示 ,查耳 酮 2′ 葡糖基轉(zhuǎn)移酶 ( THC 2′ 2glucosyltransferase , THC2′ GT) 催化 THC 合成花瓣液泡中能穩(wěn)定存在的黃色花 色素 ISP 。 等 ( 2002) 發(fā)現(xiàn) THC2′ 在黃色香石竹 Itoh GT 21114 　 查耳酮還原酶 　 在一些開黃色花的菊科植 物中 ,查耳酮還原酶 ( chalcone reductase ,CHR) 與 CHS

研究表明 ,除歐芹 、 金魚草和擬南芥 ( Arabidopsis thaliana ) 基因組中的 CHS 為單拷貝外 , 迄今鑒定過 的所 有 植 物 的 CHS 都 以 多 基 因 家 族 形 式 存 在 (Martin ,1993) 。不同 CHS 成員的組織發(fā)育和環(huán)境 誘導(dǎo) 的 特 異 性 表 達(dá) 在 豌 豆 ( Pisum sativum ) ( Ito et al . ,1997) 、 牽牛 ( Pharbifis nil ) ( Durbin et al . ,2000) 、 葡萄 ( Vitis vinifera ) ( G 2Yamamoto et al . ,2002 ) 、 oto 蝴 蝶蘭 ( Phalaenopsis hybrida ) ( Han et al . ,2006) 等植物 中得到驗(yàn)證 。在此基礎(chǔ)上 ,通過操作 CHS 進(jìn)行花色 基因工程改良的探索也迅速展開 , 并因其處于花色 素苷合成途徑的起始位置 , 抑制其表達(dá)已成為目前 淺色花色育種中廣泛采用的手段 。van der Krol 等 (1988) 首次將反義 CHS 導(dǎo)入紫色矮牽牛 ( Petunia
hybrida) 中 ,明顯抑制了花色苷的形成 , 得到開白花

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)從中篩選出 2 條編碼蛋白具有合 成查耳酮 2′ 糖苷活性的 cDNA 克隆 , 分別命名為 DicGT4 和 DicGT5 。目前 , THC2′ 的 cDNA 克隆已 GT 從香石竹中得到分離 , 并通過過表達(dá)該基因促使了 矮牽 牛 花 瓣 中 ISP 的 積 累 ( Ishida et al . , 2003 ; Okuhara et al . ,2004) 。

的植株 ; Fukusaki 等 ( 2004 ) 利用 RNAi 技術(shù) , 使藍(lán)色 夏堇 ( Torenia hybrida ) 中的 CHS 基因沉默后 ,獲得了

開白色和灰白色花的轉(zhuǎn)基因植株 ; 此外 , 成功的例 子在非洲菊 ( Gerbera hybrida ) 、 菊花 、 月季 、 香石竹 、 洋 桔 梗 ( Eustoma grandiflorum ) 和 龍 膽 ( Gentiana triflora ) 中也相繼報(bào)道 ( Tanaka et al . ,1998 ; 2005) 。
21112 　 查耳酮異構(gòu)酶 　 在植物體細(xì)胞質(zhì)內(nèi) ,查耳酮 異構(gòu)酶 ( chalcone isomerase , CHI) 催化查耳酮分子的

共同作用 , 將 THC 轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的 6′ 脫氧查耳酮 。 由于 6′ 脫氧查耳酮是大豆異黃酮的合成前體 , 因 此 CHR 基 因 最 早 從 大 豆 中 獲 得 ( Welle et al . , 1991) 。目前 ,紫花苜蓿 ( Medicago sativa ) (Ballance et al . ,1995 ) 、 甘 草 ( Glycyrrhiza echinata ) ( Akashi et 刺 al . ,1996) 、 長(zhǎng)喙田菁 ( Sesbania rostrata ) ( G oormachtig et al . ,1999) 等植物中的 CHR 也得到分離 。序列分 析發(fā) 現(xiàn) , CHR 屬 于 醛 酮 還 原 酶 超 家 族 ( aldo2keto reductase superfamily ,AKR) , 在植物體內(nèi)以多拷貝存 在 。 過 表 達(dá) 葛 藤 ( Pueraria montana var. lobata ) 在 色由 紅 色 變 為 白 色 或 粉 色 ( Joung et al . , 2003 ) ; Shimada 等 ( 2006 ) 將百脈根 ( Lotus japonicus ) CHR 導(dǎo)

環(huán)化 ,將黃色的 THC 轉(zhuǎn)化成無色的柚皮素 ( 圖 1 ) 。 由于 THC 是合成黃色花花色素的重要底物 ,而柚皮 素是其他類黃酮物質(zhì)合成的直接前體 , 可以進(jìn)一步 形成黃酮醇或花色素苷等紅色 、 藍(lán)色花卉的主要色 素來源 ,因此 CHI 在黃色花花色素生物合成中起關(guān) 鍵作用 。 CHI 最早從菜豆 ( Phaseolus vulgaris ) 中以抗體技 術(shù)分離 ( Mehdy et al . ,1987) 。香石竹 、 大豆 ( Glycine

入紅色矮牽牛中 ,同樣抑制了花青素的合成 ,并使花 色變淡 。 212 　 噢　生物合成相關(guān)酶及基因 噢　是類黃酮合成途徑中由查耳酮支化產(chǎn)生的

花瓣呈色過程中起重要作用 。Y oshida 等 ( 2004 ) 推 測(cè) THC2′ 基因表達(dá)量或酶活性的不同是造成不 GT 同品種黃色香石竹花瓣中 ISP 含量差異的主要原 因 。隨后 ,Ogata 等 ( 2004) 利用 RT2PCR 技術(shù)從香石 竹花瓣中分離到 18 條 GT 基因的同源序列 , 并通過
CHR 的轉(zhuǎn)基因煙草中 , 花青素含量減少了 40 % , 花

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圖1　 類黃酮類色素的生物合成途徑
Fig. 1 　 The biosynthetic pathway of flavonoids CHS : 查耳酮合酶 Chalcone synthase ; CHI : 查耳酮異構(gòu)酶 Chalcone isomerase ; THC2′ 查耳酮 2′ GT: 葡糖基轉(zhuǎn)移酶 THC 2′ 2glucosyltransferase ; CHR : FNS : 黃酮合成酶 Flavone synthase ; AS : 金魚草素合酶 Aureusidin synthase.

一類最終產(chǎn)物 , 以金魚草素 ( aureusidin) 及其糖苷為

代表 ,是形成金魚草和波斯菊等明黃色花的主要色 素來源 ( 安田 齊 ,1989 ; Nakayama ,2002) 。目前 , 有 關(guān)噢　的研究都是以金魚草為材料展開的 。然而 , 盡管早在 20 世紀(jì) 50 年代初人們就已發(fā)現(xiàn)了噢　的 鑒定直到近幾年才有所突破 。

存在 ,但其生物合成途徑中相關(guān)酶和基因的分離和 研究發(fā)現(xiàn) , 噢　由 THC 或 2′ ′ ′ ,4 - 五羥 ,4 ,6 ,3 基查耳酮 ( 2′ ′ ′ ,42pentahydroxychalcone ,PHC) 氧 ,4 ,6 ,3 化產(chǎn)生 (Nakayama ,2002) 。在噢　生物合成途徑中 ,
THC 或 PHC 首先在查耳酮 4′ O - 葡糖基轉(zhuǎn)移酶 (chalcone 4′O2glucosyltransferase ,C4′ ) 的作用下在 2 GT

細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成 THC 4′ O - 糖苷或 PHC 4′ O - 糖 -

苷 ,轉(zhuǎn)移至液泡后 , 以此為底物再在金魚草素合酶 ( aureusidin synthase ,AS) 的催化下合成噢　 ( 金魚草 素 6 - O - 糖苷) ( 圖 1 ,Ono et al . ,2006a) 。Nakayama 等 ( 2000) 首次從金魚草花瓣中獲得 AS 蛋白 ,并通過 消減雜交分離了 AmAS1 的 cDNA 克隆 ,Northern 雜交

表明該基因的表達(dá)與黃色花瓣的呈色密切相關(guān) 。后

來 AS 被證明為一種含銅糖蛋白 , 是催化噢　合成 的專一酶 ( Sato et al . ,2001 ) 。對(duì) AS 的初級(jí)結(jié)構(gòu)和 底物特異性進(jìn)行分析后 , 認(rèn)為 AS 屬于在高等植物 中廣泛存在的多酚氧化酶 ( polyphenol oxidase , PPO) 家族 (Nakayama et al . ,2000 ; 2001) 。但最新研究發(fā)

32hydroxylase ; F3′ : 黃烷酮 - 3′ 羥基化酶 Flavonoid 3′ H 2hydroxylase ; F3′ H : 黃烷酮 3′′ 羥基化酶 Flavonoid 3′′ 5′ 5 5 2hydroxylase ; DFR : 二氫黃酮

查耳酮還原酶 Chalcone reductase ; C4′ 查耳酮 4′ O - 葡糖基轉(zhuǎn)移酶 Chalcone 4′O2glucosyltransferase ; F3H : 黃烷酮 - 3 - 羥基化酶 Flavanone GT: 2 醇 4 - 還原酶 Dihydroflavonol 42reductase ; ANS : 花色素合成酶 Anthocyanidin synthase ; 3 GT: 類黃酮 3 - O - 葡糖基轉(zhuǎn)移酶 32G lucosyltransferases ;

現(xiàn) ,與 PPO 家族定位于質(zhì)體不同 ,AmAS1 通過高爾

基體由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移定位在液泡內(nèi) , 進(jìn)一步證明噢 合 成 于 液 泡 內(nèi) , 而 并 非 細(xì) 胞 質(zhì) 內(nèi) ( Ono et al . , 2006b) 。
213 　 葉黃素生物合成相關(guān)酶及基因

在類胡蘿卜素生物合成途徑中 ( 圖 2 ) , 合成前 體異 戊 烯 焦 磷 酸 ( isopentenyl pyrophosphate , IPP) 在 IPP 異構(gòu)酶 ( isopentenyl pyrophosphate isomerase , IPPI) 的作用下異構(gòu)化為二甲基丙烯焦磷酸 ( dimethylallyl
diphosphate ,DMAPP) ,然后在　牛兒基　牛兒基焦磷 酸合酶 ( geranylgeranyl pyrophosphate synthase , GGPS)

催化下 ,DMAPP 與 3 個(gè) IPP 分子縮合生成含有 20 個(gè) 碳 的 　 牛 兒 基 　 牛 兒 基 焦 磷 酸 ( geranylgeranyl pyrophosphate , GGPP) 。兩分子的 GGPP 經(jīng)頭對(duì)頭縮 合 ,由八氫番茄紅素合酶 ( phytoene synthase , PSY) 催 化形成具 40 個(gè)碳原子的八氫番茄紅素 ( phytoene ) 。 隨后 , 八 氫 番 茄 紅 素 在 八 氫 番 茄 紅 素 脫 氫 酶 (phytoene desaturase ,PDS) 、 - 胡蘿卜素脫氫酶 ( ζ ζ carotene desaturase , ZDS ) 和 類 胡 蘿 卜 素 異 構(gòu) 酶
( carotenoid isomerase ,CRTISO) 3 個(gè)酶的共同催化下經(jīng)

ε cyclase ,LCYE) 催化的番茄紅素環(huán)化是植物體內(nèi)類 2 胡蘿卜素合成途徑的一個(gè)重要分支點(diǎn) , 環(huán)化產(chǎn)物主

4 步去飽和反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榉鸭t素 ( lycopene) 。由β 環(huán) 化酶 ( lycopene β cyclase ,LCY ) 和ε 環(huán)化酶 ( lycopene 2 B

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β- 胡蘿卜素在 BCH 作用下轉(zhuǎn)變成β- 隱黃質(zhì) ,進(jìn)而 生成 玉 米 黃 質(zhì) 。玉 米 黃 質(zhì) 在 玉 米 黃 質(zhì) 環(huán) 氧 化 酶

1998 ; 鄭陽霞等 ,2006) �；蜣D(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)分

2003) ; 萬壽菊花瓣中隨著 LCYB 表達(dá)量的增加 , 花

要為含 1 個(gè)β- 環(huán)和 1 個(gè)ε- 環(huán)的α- 胡蘿卜素及其 衍生物 ,以及含 2 個(gè)β- 環(huán)的β - 胡蘿卜素及其衍生 物 ( Grotewold ,2006 ; Tanaka et al . ,2008b) 。 α- 胡蘿卜素和β - 胡蘿卜素是葉黃素類化合 α β 物的合成前體 。 - 胡蘿卜素在β - 環(huán)羥化酶 ( 2 hydroxylase , BCH ) 和 ε - 環(huán) 羥 化 酶 (ε hydroxylase , 2 ECH) 的共同作用下生成葉黃素 ( Tian et al . ,2004) 。
IPPI : IPP 異構(gòu)酶 Isopentenyl pyrophosphate isomerase ; GGPS :

(zeaxanthin epoxidase , ZEP ) 作 用 下 生 成 花 藥 黃 質(zhì) (antheraxanthin) , 進(jìn)而生成堇菜黃質(zhì) 。在強(qiáng)光脅迫

圖2　 植物類胡蘿卜素的生物合成途徑 ( Tanaka et al . ,2008b)
Fig. 2 　 Carotenoid biosynthesis pathway in plants( Tanaka et al . ,2008b)

牛兒基　牛兒基焦磷酸合酶 Geranylgeranyl pyrophosphate synthase ; PSY: 八氫番茄紅

　　 在上述途徑中 , 涉及葉黃素生物合成的酶和基 因已在多種植物中分離和鑒定 ( Cunningham et al . , 析表明 ,類胡蘿卜素合成基因參與花色形成的轉(zhuǎn)錄 調(diào)控 。如黃花龍膽 ( Gentiana lutea ) 花發(fā)育過程中 ,
LCYB 和 LCYE 表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)弱決定了由α - 胡蘿卜

素生成的葉黃素和β- 胡蘿卜素生成的玉米黃質(zhì)和 新黃質(zhì)在 類 胡 蘿 卜 素 總 量 中 的 比 例 ( Zhu et al . , 色由白色到黃色 、 深黃色轉(zhuǎn)變 (Del et al . ,2005) 。

早期植物類胡蘿卜素遺傳工程主要以增加糧食 作物的類胡蘿卜素含量為目的展開 ( Sandmann et
narcissus ) PS Y 、 LCYB 基因和細(xì)菌八氫番茄紅素脫氫

酶 crtI 基 因 一 起 構(gòu) 成 表 達(dá) 載 體 轉(zhuǎn) 入 到 一 個(gè) 水 稻 ( Oryza sativa ) 品種中 ,得到胚乳呈黃色的 “金大米” 。 后來 ,煙草 、 番茄 、 馬鈴薯 ( Solanum tuberosum ) 等植物 組織中類胡蘿卜素含量的提高也相繼實(shí)現(xiàn) ( Ralley et
al . ,2004 ; Morris et al . ,2006) 。然而 ,類胡蘿卜素基

因工程在花色分子育種中的應(yīng)用還很少 。Ohmiya 等 ( 2006) 發(fā)現(xiàn)白色菊花中雖有類胡蘿卜素的合成 , 但隨后卻在類胡蘿卜素裂解雙加氧酶 CmCCD4a 的

al . ,2006) 。Ye 等 ( 2000 ) 將黃水仙 ( Narcissus pseudo2

BCH β- 環(huán)羥化酶β Hydroxylase ; ECH ε- 環(huán)羥化酶ε Hydroxylase ; ZEP : 玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶 Zeaxanthin epoxidase ; VDE : 堇菜黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶 : 2 : 2 Violaxanthin de2epoxidase ; NSY: 新黃質(zhì)合酶 Neoxanthin synthase.

素合酶 Phytoene synthase ; PDS : 八氫番茄紅素脫氫酶 Phytoene desaturase ; Z2ISO : 類胡蘿卜素異構(gòu)酶 Carotenoid isomerase ; ZDSζ- 胡蘿卜素脫氫 : 酶ζ Carotene desaturase ; CRTISO : 類胡蘿卜素異構(gòu)酶 Carotenoid isomerase ; LCYE ε環(huán)化酶 Lycopeneεcyclase ; LCY β環(huán)化酶 Lycopeneβ cyclase ; 2 : 2 B: 2

下 ,堇菜黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶 ( violaxanthin de2epoxidase , VDE) 催化堇菜黃質(zhì)轉(zhuǎn)化為花藥黃質(zhì) ,進(jìn)而再轉(zhuǎn)化為 玉米 黃 質(zhì) 。堇 菜 黃 質(zhì) 在 新 黃 質(zhì) 合 酶 ( neoxanthin
synthase ,NSY) 催化下轉(zhuǎn)化為高等植物類胡蘿卜素生 物合 成 β,β 分 支 的 最 終 產(chǎn) 物 —— 黃 質(zhì) ( 圖 2 , —新 Grotewold ,2006 ; Tanaka et al . ,2008b) 。

作用下裂解 ,從而使花瓣表現(xiàn)白色 ; 抑制 CmCCD4a

的表達(dá)可使花瓣由白色變?yōu)辄S色 ; 反之 , 過表達(dá) CmCCD4a 可使花瓣由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榘咨?( Tanaka et
al . ,2008a) 。Suzuki 等 ( 2007) 將細(xì)菌中編碼β - 胡蘿

卜素酮化酶的 crtW 基因在百脈根中過表達(dá) ,使其花 瓣和 葉 片 中 積 累 了 蝦 青 素 ( astaxanthin ) 、 黃 素 角 由淺黃色轉(zhuǎn)變成深黃色或橙色 。

(canthaxanthin) 等新的類胡蘿卜素化合物 , 花朵顏色

3　 黃色花基因工程的主要途徑

通過上述分析可以發(fā)現(xiàn) , 實(shí)現(xiàn)黃色花分子育種

主要有以下 2 條途徑 : 對(duì)于不含類胡蘿卜素的物種 , 破口 ,通過基因工程調(diào)控類黃酮的合成方向 ,抑制花

可以查耳酮和噢　生物合成途徑中的關(guān)鍵基因?yàn)橥?青素的合成和促進(jìn)查耳酮或噢　的積累 ; 而花瓣內(nèi) 抑制花青素的合成 ,使花瓣中只積累類胡蘿卜素 ,也 能使花色變黃 。

同時(shí)含有類黃酮和類胡蘿卜素 2 類物質(zhì)的物種中 ,

311 　 抑制花青素的合成促進(jìn)花瓣中查耳酮的積累

大量證據(jù)表明 ,CHI 活性的抑制是通過積累查

耳酮 類 化 合 物 使 花 朵 呈 現(xiàn) 黃 色 的 先 決 條 件 (Nishihara et al . ,2005 ) 。但目前 , 通過該方法進(jìn)行

116

林

業(yè)

科

學(xué)

45 卷 　

花色改良的研究?jī)H在煙草中有所報(bào)道 。Nishihara 等 (2005) 采用 RNAi 技術(shù)抑制了煙草中 CHI 的表達(dá) , 使花瓣中花青素含量降低 ,查耳酮含量上升 ,花朵顏 色變淺 ,且花粉中也積累了大量查耳酮而表現(xiàn)黃色 。 值得注意的是 , 對(duì)于某些植物如矮牽牛 、 洋桔梗等 , 通過反義抑制或 RNAi 的方法均不能抑制 CHI 的活 性 ,或即使抑制了其活性但仍不能改變花色 ( van Blokland et al . ,1993) 。推測(cè)在這些植物體內(nèi)查耳酮 可以在 CHI 失活的情況下產(chǎn)生自發(fā)異構(gòu) , 形成黃酮 醇 。為此 ,Davies 等 ( 1998 ) 嘗試將紫花苜蓿查耳酮 還原酶基因 CHR 導(dǎo)入白色矮牽牛中 ,增強(qiáng)了查耳酮 的穩(wěn)定性 ,并促進(jìn)了它的積累 ,最終獲得開淡黃色花 的轉(zhuǎn)基因植株 。另外 , Zuker 等 ( 2002 ) 將反義 F3H 轉(zhuǎn)入到只含天竺葵色素苷的橙色香石竹中后 , 轉(zhuǎn)基 因株系中 F3H 的表達(dá)受到抑制 ,只積累了痕量的天 竺葵色素苷 ,并由于其自身具有合成 ISP 的活性 ,從 而使花色變成了黃色或乳黃色 。 312 　 導(dǎo)入新基因和基因抑制相結(jié)合促使噢　的合成 噢　生物合成相關(guān)基因的分離使得通過導(dǎo)入這 些外源基因來實(shí)現(xiàn)黃色花分子育種成為可能 。在類 黃酮代謝途徑中 ( 圖 1) ,噢　合成酶 C4′ 和 AS 與 GT 沒有檢測(cè)到噢　的合成 , 花朵顏色也未發(fā)生改變 ; 而將 AmAS 和 C4′ 共同表達(dá)時(shí) ,花色變成了黃色 , GT 但仍能積累較多的花青素 ; 最后 ,通過 RNAi 技術(shù)抑 制花青素合成相關(guān)基因 F3H 或 DFR 的表達(dá) , 再共
314 　 通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花色素的合成

植物的花青素合成過程中 。然而 , 盡管花色素苷轉(zhuǎn) 錄因子的調(diào)控作用模式在玉米 ( Zea mays ) 、 擬南芥 、 矮牽牛等植物中已獲得較深入的研究 ( K oes et al . , 2005) ,但已知的轉(zhuǎn)錄因子主要參與花色素苷生物合 成后期階段的調(diào)控 , 且轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)在花色改良中的應(yīng) 用主要集中在過表達(dá)這些調(diào)控因子以促進(jìn)花色素苷 合成的研究中 ,如 Ray 等 ( 2003) 將玉米 MYC ( bHLH) 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因 Lc 轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中后 ,轉(zhuǎn)化植株 中 CHS 、 F3H 基因的表達(dá)明顯增強(qiáng) , 花色素苷大量 積累 ,植株表現(xiàn)紫紅色 。同時(shí) ,也有證據(jù)表明該方法 具有正向與反向的雙重作用 。Aharoni 等 ( 2001 ) 將 草莓 ( Fragaria grandiflora ) FaMYB 1 轉(zhuǎn)入煙草中過量

CHI 、 等花青素合成酶存在底物競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)系 , 它 F3H

們分別催化查耳酮向噢　和花青素的方向代謝 。因 此 ,在導(dǎo)入外源新基因的同時(shí) ,必須與抑制花青素合 成基因相結(jié)合才能最大限度地積累噢　 。Ono 等 (2006a) 在藍(lán)花的夏堇中異源表達(dá)金魚草 AmAS1 , 并

4　 存在的問題及展望

同表達(dá) AmAS1 和 C4′ , 成功得到了后代的花朵中 GT 幾乎不能積累花青素的開黃色花的轉(zhuǎn)基因植株 。 313 　 抑制花青素基因的表達(dá)只積累類胡蘿卜素 對(duì)于花瓣中既含有花青素又含有類胡蘿卜素的 種或品種 ,通過抑制花青素生物合成相關(guān)基因的表

達(dá) ,阻斷其在花瓣中的積累 ,而類胡蘿卜素的合成和 積累并不受影響 , 從而使花色變成黃色 。Suzuki 等 ( 2000) 抑制了深褐紫色夏堇花瓣中的 CHS 表達(dá) , 花 青素的合成即被阻斷 , 由于植株中同時(shí)含有類胡蘿 卜素 ,因而轉(zhuǎn)基因后代中出現(xiàn)了開淡黃色花的植株 。 除直接編碼花色素生物合成酶的結(jié)構(gòu)基因外 , 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因通過調(diào)節(jié)生物合成酶活性和色素 積累基因的時(shí)空表達(dá)等方式也在花色形成中起著重 要作用 。因此 ,在花色基因工程改良中 ,也可以利用

轉(zhuǎn)錄因子以增強(qiáng)或減弱原有代謝產(chǎn)物來改變花色 。 目前 , 研究較多的花色素苷基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 主要有 baisc2helix2loop2helix ( bHLH) 和 R2R32MY 兩 B 大類相互作用的轉(zhuǎn)錄因子 ( Springob et al . , 2003 ) 。 此外 ,WD40 類蛋白的調(diào)控作用也廣泛存在于多種 表達(dá)后 ,轉(zhuǎn)化植株花瓣中花色素苷合成酶 ANS 、 GT 的活性降低 ,其基因表達(dá)受到抑制 ,花色素苷積累明 顯減少 ,花冠由粉紅色變?yōu)榘咨?。 研究發(fā)現(xiàn) , 噢　生物合成調(diào)控機(jī)制獨(dú)立于花色 素苷的合成調(diào)控 ( Schwinn et al . ,2006) , 但有關(guān)噢　 生物合成調(diào)控因子的了解很少 。Davies 等 ( 2006) 在 金魚草中發(fā)現(xiàn)了 2 個(gè)調(diào)控噢　合成的基因座 , 即 Sulf urea 和 Violacea 。隱性的 sulf urea 等位基因能夠 促進(jìn)噢　的生成 , 因此該等位基因?qū)︵蕖〉纳锖?成有負(fù)調(diào)控或競(jìng)爭(zhēng)作用 ; 而 violacea 等位基因則對(duì) 噢　生物合成基因的空間表達(dá)起調(diào)控作用 。 步研究 : 如黃色花形成化學(xué)機(jī)制的進(jìn)一步闡明 ; 黃 色花花色素生物合成途徑中新基因的分離 ; 黃色花 呈色過程中相關(guān)內(nèi)源基因表達(dá)規(guī)律的研究 ; 黃色花 花色素生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的分離 ; 類黃酮和類 胡蘿卜素生物合成調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步研究 ; 轉(zhuǎn)錄因 子蛋白質(zhì)如何相互作用來協(xié)作調(diào)節(jié)花色素的生物合 成 ; CHI 基因正 、 反義抑制失敗原因的闡明 ; 花器官 特異表達(dá)啟動(dòng)子的克隆和應(yīng)用 ; 轉(zhuǎn)類胡蘿卜素合成 相關(guān)基因的黃色花基因工程的研究 ; 色素間相互關(guān) 系及共同著色的研究 ; 其他因子如花色素苷生物合

綜上所述 , 植物類黃酮和類胡蘿卜素生物合成 途徑中有關(guān)黃色花形成的大多數(shù)酶和基因均已被分 離和鑒定 ,并且黃色花基因工程也取得了一定進(jìn)展 。 但是 ,目前針對(duì)黃色花形成機(jī)制 ,尤其是黃色花分子 育種的研究還處于起步階段 , 很多方面還有待進(jìn)一

　 2期 第

周　 琳等 : 黃色花形成機(jī)制及基因工程研究進(jìn)展

117

成的液泡扣押與沉積 、 液泡內(nèi) pH 值 、 金屬元素的含 量和花瓣的結(jié)構(gòu)等對(duì)黃色花呈色的影響等 。而且 , 盡管噢　合成基因的克隆為黃色花分子育種提供了 一條新的思路并具有廣闊的應(yīng)用前景 , 但表達(dá)載體 中花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子的選擇及外源基因?qū)牒?如何克服基因沉默 , 保證其在植物體內(nèi)能夠穩(wěn)定遺 傳與表達(dá)也是黃色花基因工程研究中的重要問題 。 另外 ,目前有關(guān)甜菜色素生物合成的研究還非常有 限 ,其合成途徑中的關(guān)鍵酶和基因仍未得到分離 ,轉(zhuǎn) 錄調(diào)控機(jī)制及基因工程的研究更未見報(bào)道 , 因此相 關(guān)研究也亟待開展 。 植物黃色花基因工程改良是一個(gè)系統(tǒng)工程 , 單 單調(diào)控一個(gè)基因的表達(dá)難以達(dá)到預(yù)期效果 , 需要綜 合考慮相關(guān)因素 。目前 , 許多觀賞植物的遺傳轉(zhuǎn)化 體系已經(jīng)建立 ,隨著黃色花形成機(jī)制和調(diào)控機(jī)理研 究的不斷深入 ,以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完善 ,采用多 種技術(shù)手段相結(jié)合的方法 ,多方面探索 ,相信不久的 將來終能實(shí)現(xiàn)仙客來 、 天竺葵等觀賞植物的黃色花 新品種創(chuàng)制 。 參
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( 責(zé)任編輯 　 　 ) 徐 紅



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