發(fā)布時(shí)間：2017-11-11 06:16

  本文關(guān)鍵詞：SRBSDV 12個(gè)基因植物表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因水稻表型初探

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【摘要】：南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV),是呼腸孤病毒科(Reoviradae)斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus)的一個(gè)暫定新種。該病毒侵染水稻后病株表現(xiàn)矮縮,葉色深綠,葉片基部產(chǎn)生皺褶,莖節(jié)部有倒生須根及莖表瘤突、高節(jié)位分蘗及根系褐化。前人研究發(fā)現(xiàn)SRBSDV全基因組由10條線性dsRNA組成,根據(jù)各片段從大到小分別命名為S1~S10,其中S5、S7和S9分別編碼兩個(gè)蛋白其余各片段均編碼一個(gè)蛋白。目前,SRBSDV部分基因功能及其致病機(jī)理尚未清晰,尤其是病毒蛋白與寄主水稻之間的互作機(jī)制方面仍需要更深入的探索。為研究SRBSDV各基因所編碼蛋白的功能和致病機(jī)理,本研究分別構(gòu)建了SRBSDV 12個(gè)基因的植物表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,分別獲得由SRBSDV S1和S10編碼的RdRP和CP轉(zhuǎn)水稻植株,并重點(diǎn)對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因水稻的表型進(jìn)行觀察和利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)CP的相對(duì)表達(dá)量。取得如下研究結(jié)果:1.克隆了SRBSDV 12個(gè)編碼基因,構(gòu)建了12個(gè)基因的植物表達(dá)載體,并獲得了相應(yīng)的工程農(nóng)桿菌。通過RT-PCR,以SRBSDV感病水稻葉組織總RNA為模板,擴(kuò)增獲得了病毒S1、S3、S4、S5-1、S5-2、S6、S7-1、S7-2、S8、S9-1、S9-2和S10編碼的共12個(gè)基因,經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后連接到植物表達(dá)載體pCambia1302上,獲得各基因的植物表達(dá)重組質(zhì)粒,分別命名為pC1302-P1、pC1302-P3、pC1302-P4、pC1302-P51、pC1302-P52、pC1302-P6、pC1302-P71、pC1302-P72、pC1302-P8、pC1302-P91、pC1302-P92和pC1302-P10,利用電激法將上述重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105菌株中。2.分別獲得了4株轉(zhuǎn)RdRP和6株轉(zhuǎn)CP的水稻植株。以水稻品種“日本晴”胚性愈傷組織為受體,用攜帶植物表達(dá)重組質(zhì)粒pC1302-P1和pC1302-P10的農(nóng)桿菌EHA105侵染愈傷組織,經(jīng)過潮霉素抗性篩選,預(yù)分化和分化,生根煉苗等過程分別獲得4株P(guān)1陽(yáng)性和6株P(guān)10陽(yáng)性植株,Southern blot檢測(cè)外源基因S10均為單拷貝。3.對(duì)T1代P1轉(zhuǎn)基因水稻植株的表型進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),各株系T1代群體幼苗期時(shí)與非轉(zhuǎn)基因水稻表型沒有明顯差異。分蘗期時(shí),部分轉(zhuǎn)基因水稻植株表現(xiàn)出白化現(xiàn)象。白化植株的心葉表現(xiàn)正常,但其余葉片均有不同程度的白化,且長(zhǎng)勢(shì)較弱。4.獲得了T1代P10轉(zhuǎn)基因水稻植株,并對(duì)其進(jìn)行了分子檢測(cè)和表型觀察。對(duì)T1代P10轉(zhuǎn)基因水稻植株進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果表明,6個(gè)株系的外源基因基本均以3:1的比例進(jìn)行遺傳分離,符合孟德爾單基因遺傳規(guī)律。T1代P10轉(zhuǎn)基因植株幼苗期時(shí)與非轉(zhuǎn)基因植株沒有明顯的表型差異。分蘗期時(shí),部分轉(zhuǎn)基因植株長(zhǎng)勢(shì)明顯減弱,表現(xiàn)出矮化,分蘗減少等表型。5.建立了轉(zhuǎn)基因水稻病毒CP相對(duì)表達(dá)量RT-qPCR檢測(cè)技術(shù)。利用RT-qPCR技術(shù),分別在幼苗期、分蘗期和抽穗期對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻植株的病毒CP的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果表明,外源基因在轉(zhuǎn)基因水稻三個(gè)時(shí)期均能成功轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究病毒P1和P10兩個(gè)基因在SRBSDV侵染水稻過程中的致病機(jī)制提供了材料基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S435.11

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1170164