本文關(guān)鍵詞：褶紋冠蚌Kunitz型和Serpin B型絲氨酸蛋白酶抑制劑基因克隆與表達(dá)

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【摘要】：本文從褶紋冠蚌(Cristaria plicata)中克隆到了絲氨酸蛋白酶抑制劑Kunitz基因和Serpin B基因的c DNA全長(zhǎng)序列,并對(duì)其同源性和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,采用定量PCR方法檢測(cè)這2個(gè)基因在褶紋冠蚌肝胰腺、血細(xì)胞、閉殼肌、鰓和外套膜組織中的相對(duì)表達(dá)量,利用PBS、革蘭氏陰性菌嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)和脂多糖(LPS)刺激誘導(dǎo)蚌后,檢測(cè)這2個(gè)基因在蚌的血細(xì)胞和肝胰腺組織中的表達(dá)變化。以質(zhì)粒pet-32為載體用基因重組技術(shù)構(gòu)建p ET32-Kunitz原核表達(dá)載體,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)并純化出純度較高的Kunitz的重組蛋白。褶紋冠蚌絲氨酸蛋白酶抑制劑Kunitz型基因的c DNA全長(zhǎng)序列為1378bp,其中5’UTR有128 bp;3’UTR有482 bp,含有一個(gè)poly A尾;開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)長(zhǎng)度為768 bp,編碼的蛋白質(zhì)含255個(gè)氨基酸。該蛋白序列N端有1個(gè)信號(hào)肽序列,包含17個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)。成熟肽由238個(gè)氨基酸組成。該蛋白理論等電點(diǎn)(PI)為8.32,相對(duì)分子量為28.7 k Da。其序列與茅竹蟶(Solen grandis)高度相似,為98%。Kunitz型有4個(gè)保守序列,空間結(jié)構(gòu)含有6個(gè)β折疊和3個(gè)ɑ-螺旋。Kunitz型基因在血細(xì)胞、肝胰腺、鰓、閉殼肌和外套膜都檢測(cè)到了表達(dá)量,其中在外套膜的表達(dá)量是最低的,轉(zhuǎn)錄水平最高的組織是血細(xì)胞,其次是肝胰腺。嗜水氣單胞菌刺激后的實(shí)驗(yàn)組褶紋冠蚌,與PBS對(duì)照組相比,血細(xì)胞和肝胰臟的表達(dá)量都在12 h達(dá)到最大值,肝胰臟在48 h左右恢復(fù)到0 h的表達(dá)水平,血細(xì)胞在48 h表達(dá)量仍然維持在較高水平。在脂多糖刺激組中,肝胰臟和血細(xì)胞的mRNA轉(zhuǎn)錄水平也是在12 h達(dá)到最高值,之后回落,但肝胰臟的增幅更明顯。通過(guò)質(zhì)粒p ET-32與目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET32-Kunitz在誘導(dǎo)破碎后發(fā)現(xiàn)其以可溶性蛋白主要存在于上清中。Kunitz的可溶性蛋白經(jīng)純化獲得了純度較高的重組p ET32-Kunitz,經(jīng)分析確認(rèn)所得重組蛋白在40 k Da左右,與預(yù)測(cè)的蛋白大小一致。褶紋冠蚌Serpin B cDNA全長(zhǎng)為1565 bp,包括3’端非翻譯區(qū)362 bp,5’非編碼區(qū)(UTR)長(zhǎng)21 bp,含有典型的腺苷酸信號(hào)序列AATAA和Poly A尾。該基因序列包含一個(gè)編碼393個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框(ORF),編碼區(qū)1182 bp,預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子量為44.2 k Da,等電點(diǎn)為6.57。與牡蠣(Crassostrea gigas)的同源性最高,為47%。在氨基酸25-391的位置為SERPIN結(jié)構(gòu)域,該蛋白為Serpins超家族蛋白。Serpin B型基因在血細(xì)胞、肝胰腺、鰓、閉殼肌和外套膜都檢測(cè)到了表達(dá)量,其在鰓中的轉(zhuǎn)錄水平最低,在血細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平最高,約為鰓的9.92倍,其次是肝胰臟,約為鰓的6.85倍。嗜水氣單胞菌刺激褶紋冠蚌后,與PBS對(duì)照組相比,血細(xì)胞和肝胰臟的表達(dá)量都在6~24 h增長(zhǎng)趨勢(shì)趨于緩和,在48 h達(dá)到最大,尤以肝胰臟表現(xiàn)敏感。在脂多糖刺激組中,與PBS對(duì)照組相比,肝胰臟在12 h轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高,之后在48 h回落到0 h的水平,血液的表達(dá)水平0~12 h變化不顯著,在24h達(dá)到最高值。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4

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