本文關鍵詞：褶紋冠蚌Kunitz型和Serpin B型絲氨酸蛋白酶抑制劑基因克隆與表達

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【摘要】：本文從褶紋冠蚌(Cristaria plicata)中克隆到了絲氨酸蛋白酶抑制劑Kunitz基因和Serpin B基因的c DNA全長序列,并對其同源性和三級結構進行了分析,采用定量PCR方法檢測這2個基因在褶紋冠蚌肝胰腺、血細胞、閉殼肌、鰓和外套膜組織中的相對表達量,利用PBS、革蘭氏陰性菌嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)和脂多糖(LPS)刺激誘導蚌后,檢測這2個基因在蚌的血細胞和肝胰腺組織中的表達變化。以質粒pet-32為載體用基因重組技術構建p ET32-Kunitz原核表達載體,利用大腸桿菌表達系統(tǒng)進行表達并純化出純度較高的Kunitz的重組蛋白。褶紋冠蚌絲氨酸蛋白酶抑制劑Kunitz型基因的c DNA全長序列為1378bp,其中5’UTR有128 bp;3’UTR有482 bp,含有一個poly A尾;開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)長度為768 bp,編碼的蛋白質含255個氨基酸。該蛋白序列N端有1個信號肽序列,包含17個氨基酸結構。成熟肽由238個氨基酸組成。該蛋白理論等電點(PI)為8.32,相對分子量為28.7 k Da。其序列與茅竹蟶(Solen grandis)高度相似,為98%。Kunitz型有4個保守序列,空間結構含有6個β折疊和3個ɑ-螺旋。Kunitz型基因在血細胞、肝胰腺、鰓、閉殼肌和外套膜都檢測到了表達量,其中在外套膜的表達量是最低的,轉錄水平最高的組織是血細胞,其次是肝胰腺。嗜水氣單胞菌刺激后的實驗組褶紋冠蚌,與PBS對照組相比,血細胞和肝胰臟的表達量都在12 h達到最大值,肝胰臟在48 h左右恢復到0 h的表達水平,血細胞在48 h表達量仍然維持在較高水平。在脂多糖刺激組中,肝胰臟和血細胞的mRNA轉錄水平也是在12 h達到最高值,之后回落,但肝胰臟的增幅更明顯。通過質粒p ET-32與目的基因構建重組質粒p ET32-Kunitz在誘導破碎后發(fā)現(xiàn)其以可溶性蛋白主要存在于上清中。Kunitz的可溶性蛋白經純化獲得了純度較高的重組p ET32-Kunitz,經分析確認所得重組蛋白在40 k Da左右,與預測的蛋白大小一致。褶紋冠蚌Serpin B cDNA全長為1565 bp,包括3’端非翻譯區(qū)362 bp,5’非編碼區(qū)(UTR)長21 bp,含有典型的腺苷酸信號序列AATAA和Poly A尾。該基因序列包含一個編碼393個氨基酸的開放閱讀框(ORF),編碼區(qū)1182 bp,預測蛋白質相對分子量為44.2 k Da,等電點為6.57。與牡蠣(Crassostrea gigas)的同源性最高,為47%。在氨基酸25-391的位置為SERPIN結構域,該蛋白為Serpins超家族蛋白。Serpin B型基因在血細胞、肝胰腺、鰓、閉殼肌和外套膜都檢測到了表達量,其在鰓中的轉錄水平最低,在血細胞中轉錄水平最高,約為鰓的9.92倍,其次是肝胰臟,約為鰓的6.85倍。嗜水氣單胞菌刺激褶紋冠蚌后,與PBS對照組相比,血細胞和肝胰臟的表達量都在6~24 h增長趨勢趨于緩和,在48 h達到最大,尤以肝胰臟表現(xiàn)敏感。在脂多糖刺激組中,與PBS對照組相比,肝胰臟在12 h轉錄水平達到最高,之后在48 h回落到0 h的水平,血液的表達水平0~12 h變化不顯著,在24h達到最高值。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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