本文關(guān)鍵詞：油菜BnAtg8-擬南芥轉(zhuǎn)基因系的建立及其自噬功能的研究

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【摘要】：自噬(Autophagy,AP)是一種重要的細(xì)胞分子生物學(xué)活動,通過對受損或死亡的細(xì)胞、細(xì)胞器以及生物大分子的降解和再利用,在維持細(xì)胞的靜態(tài)平衡、發(fā)育模式重構(gòu)、自體免疫以及抵抗逆境脅迫過程中發(fā)揮重要的用。自噬的早期研究主要集中于酵母,隨后擴(kuò)展到動物細(xì)胞,相比而言,植物自噬的研究起步較晚,并且主要集中在離體培養(yǎng)的細(xì)胞,而在個(gè)體水平上的研究相對較少。本研究利用攜帶GFP標(biāo)簽和甘藍(lán)型油菜自噬相關(guān)基因Atg8(Bn Atg8)的表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥,得到了相應(yīng)Bn Atg8轉(zhuǎn)基因系,并通過形態(tài)學(xué)比較、GFP和MDC熒光檢測以及RT-PCR等技術(shù),分析比較了擬南芥野生型、BnAtg8轉(zhuǎn)基因系以及自噬atg5和atg7突變體在正常生長和逆境脅迫條件下在形態(tài)學(xué)、生理生化、細(xì)胞以及分子生物學(xué)中的差異,探究了自噬在植物生長發(fā)育以及抗逆活動中的功能。主要結(jié)果如下:(1)通過轉(zhuǎn)化及PCR鑒定,成功獲得了3個(gè)Bn Atg8-擬南芥轉(zhuǎn)基因純合系,其中兩個(gè)GFP和BnAtg8二者都有表達(dá)(GFP-Bn Atg8轉(zhuǎn)基因系),另一個(gè)只Bn Atg8表達(dá)(BnAtg8轉(zhuǎn)基因系)。(2)通過半定量RT-PCR法分析比較了20、40、60天苗齡的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片以及50天苗齡植株的葉片、花序莖及果莢中Bn Atg8基因的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同苗齡轉(zhuǎn)基因系葉片中BnAtg8基因的轉(zhuǎn)錄水平存在顯著的差異,其中60天的轉(zhuǎn)錄水平高于40和20天的轉(zhuǎn)錄水平,40天的轉(zhuǎn)錄水平又高于20天的轉(zhuǎn)錄水平(60d40d20d).此外,在葉片中的表達(dá)水平高于在花序莖和果莢中的表達(dá)水平,在花序莖中的表達(dá)水平又高于在果莢中的表達(dá)水平(葉片花序莖果莢)。(3)激光共聚焦顯微觀察轉(zhuǎn)基因系根尖GFP熒光分布發(fā)現(xiàn),綠色熒光廣泛分布在根尖的各個(gè)部位,熒光呈點(diǎn)狀分布,其熒光強(qiáng)度從分生區(qū)到伸長區(qū)至根冠依次減弱。觀察轉(zhuǎn)基因植株花粉形成過程中不同時(shí)期中細(xì)胞內(nèi)GFP熒光發(fā)現(xiàn),熒光也呈點(diǎn)狀分布,并且在四分體時(shí)期的熒光強(qiáng)度要高于小孢子。(4)自噬體(泡)特異染色劑MDC染色后熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因植株和野生型根尖所有區(qū)域都顯示MDC熒光,但轉(zhuǎn)基因根尖的熒光強(qiáng)度高于野生型根尖的熒光強(qiáng)度。(5)觀察分析轉(zhuǎn)基因系、野生型和自噬突變體生長過程中的表型發(fā)現(xiàn),在初生根和下胚軸的生長方面,轉(zhuǎn)基因系的生長速率大于野生型的生長速率,而野生型的生長速率又大于自噬突變體的生長速率;在葉面積方面,轉(zhuǎn)基因型的最大,為野生型次之,自噬突變體的最小。在抽薹期方面,轉(zhuǎn)基因系和自噬突變體的相對于野生型的都明顯提前,生長周期縮短,其中自噬缺失突變體的變化更為明顯。此外,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因系的株高和種子產(chǎn)量沒有明顯的改變,而自噬突變體的株高明顯變矮,單株種子產(chǎn)量也明顯降低。(6)生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn):在饑餓脅迫下,野生型和轉(zhuǎn)基因系的萌發(fā)率無明顯差異,但是兩個(gè)自噬突變體的萌發(fā)率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生型;在鹽脅迫下,在種子萌發(fā)率方面,轉(zhuǎn)基因系明顯地高于自噬突變體,但又低于野生型。以上結(jié)果表明,油菜BnAtg8的表達(dá)對擬南芥的生長發(fā)育,耐環(huán)境脅迫的能力以及自噬活動的強(qiáng)度有明顯的影響。這種情況表明,自噬在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育方面也可能發(fā)揮一定的作用。這種作用對于植物的生長發(fā)育來說既有積極的的一面也有消極的一面,只有適量強(qiáng)度的自噬才利于植物的生長發(fā)育。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2

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