發(fā)布時(shí)間：2017-11-07 00:31

  本文關(guān)鍵詞：棉花（Gossypium hirsutum）PYL基因的分離與鑒定

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【摘要】：棉花是非常重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,在世界各地都有種植。棉花的主產(chǎn)品棉纖維是一種天然的紡織纖維,是紡織工業(yè)的重要原材料。在棉花生長(zhǎng)發(fā)育中,常常出現(xiàn)一些不利的環(huán)境條件,例如干旱、水澇、低溫、高鹽等。這些不利的環(huán)境因素嚴(yán)重影響棉花正常生長(zhǎng),造成減產(chǎn)減收。如何提高棉花品種對(duì)上述不良環(huán)境的抗性是目前各國(guó)研究人員關(guān)注的問題,其中通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)向棉花基因組中引入新的抗逆基因是一種非常具有前景的策略。脫落酸(ABA)是一種植物激素,ABA核心信號(hào)通路在植物對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ABA受體PYL蛋白、負(fù)調(diào)控因子A類PP2C蛋白、正調(diào)控因子SnRK2s蛋白和下游的效應(yīng)因子共同組成了一條完整的ABA核心信號(hào)通路。對(duì)棉花中編碼這些蛋白的基因進(jìn)行克隆鑒定和功能研究,有助于更好地理解棉花ABA信號(hào)通路,從而為棉花抗逆基因的篩選鑒定提供線索。本文在棉花基因組中分離了27個(gè)編碼棉花ABA的受體PYL蛋白的基因,命名為GhPYLl-27,對(duì)這些PYL基因及其編碼蛋白進(jìn)行了序列與進(jìn)化分析、組織表達(dá)和脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析,以及它們與PP2C蛋白的相互作用及轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析等,主要結(jié)果如下：1、棉花PYL基因的分離鑒定和序列結(jié)構(gòu)及進(jìn)化分析依據(jù)與擬南芥PYL蛋白的序列相似性,我們從棉花基因組中分離了27個(gè)GhPYL基因,這些基因的ORF長(zhǎng)約600bp,編碼的氨基酸數(shù)目在200個(gè)左右,在一些二級(jí)結(jié)構(gòu)上非常保守。依據(jù)與擬南芥PYL蛋白的同源性可將其分為三個(gè)亞組。2、棉花PYL基因的組織表達(dá)和脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析分析了其中9個(gè)GhPYL基因在棉花組織中的表達(dá)譜,結(jié)果顯示它們具有不同的組織表達(dá)模式。GhPYL1在根、下胚軸、子葉中的表達(dá)量相對(duì)較高,GhPYL8、 GhPYL12在根中強(qiáng)烈表達(dá),而GhPYL26在各組織中表達(dá)量相差不大。利用定量RT-PCR技術(shù)對(duì)5個(gè)棉花PYL基因(GhPYLl、GhPYL8、GhPYLl0、GhPYL12和GhPYL26)的表達(dá)進(jìn)行了定量分析,研究它們是否在干旱脅迫下誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果顯示在晉棉13號(hào)受到干旱脅迫后,這5個(gè)GhPYL基因均出現(xiàn)了下調(diào)表達(dá)。3、棉花PYL蛋白與PP2C蛋白在酵母中的相互作用將GhPYL基因構(gòu)建到AD載體,GhPP2C基因構(gòu)建到BD載體,轉(zhuǎn)化酵母進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明GhPYL8、GhPYL10、GhPYL12、GhPY22、GhPYL25和GhPYL26蛋白能夠與棉花PP2C蛋白在酵母中發(fā)生相互作用,并且這種相互作用具有選擇性。4、GhPYL1蛋白的亞細(xì)胞定位分析構(gòu)建GFPrGhPYL1融合蛋白表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥,獲得轉(zhuǎn)基因植株。在共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗根部細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)GFP應(yīng)該主要分布在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中,這表明GhPYLl蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。5、過量表達(dá)GhPYL轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)ABA的敏感性分析構(gòu)建GhPYL10、GhPYL12、GhPYL26的過量表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥,獲得轉(zhuǎn)基因株系。統(tǒng)計(jì)野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥在含ABA的MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)率和綠苗率發(fā)現(xiàn),3個(gè)GhPYL基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥相比野生型均萌發(fā)更慢,幼苗生長(zhǎng)受到ABA更嚴(yán)重的抑制,說明過量表達(dá)GhPYLs增加了擬南芥在種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)ABA的敏感性。6、過量表達(dá)GhPYL轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)NaCl的敏感性分析統(tǒng)計(jì)野生型和GhPYL10、GhPYL12、GhPYL26的轉(zhuǎn)基因擬南芥在含NaCl的MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)率和綠苗率發(fā)現(xiàn),過量表達(dá)GhPYL10和GhPYL12轉(zhuǎn)基因擬南芥萌發(fā)率和綠苗率比野生型更低,而過量表達(dá)GhPYL26轉(zhuǎn)基因擬南芥萌發(fā)率低于野生型。7、過量表達(dá)GhPYL轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)甘露醇的敏感性分析統(tǒng)計(jì)野生型和GhPYL10、GhPYL12、GhPYL26的轉(zhuǎn)基因擬南芥在含甘露醇的MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)率和綠苗率,結(jié)果顯示野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的的萌發(fā)率和綠苗率沒有顯著差異。8、過量表達(dá)GhPYL轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長(zhǎng)分析統(tǒng)計(jì)野生型和GhPYL10、GhPYL12、GhPYL26轉(zhuǎn)基因擬南芥在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)10天后的主根長(zhǎng)度,發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)GhPY12和GhPYL26轉(zhuǎn)基因擬南芥主根長(zhǎng)度比野生型更長(zhǎng),而過量表達(dá)GhPYL10轉(zhuǎn)基因擬南芥主根長(zhǎng)度與野生型無顯著差異,說明過量表達(dá)GhPYL12和GhPYL26能促進(jìn)擬南芥幼苗時(shí)期主根的生長(zhǎng)發(fā)育。
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2;S562

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