本文關鍵詞：鴨IFNα-IFNγ、IFNα-IL18基因的融合表達及其生物學活性研究

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【摘要】：干擾素(interferon,IFN)是一類在同種細胞上具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)等多種生物學功能的細胞因子。國際干擾素命名委員會根據(jù)干擾素的抗原特性和分子結構的差異,將干擾素分為3個型。α干擾素(IFN-α)屬Ⅰ型干擾素,主要參與機體抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)過程。γ干擾素(IFN-γ)屬于Ⅱ型干擾素,IFN-γ可誘導病毒感染的細胞表達病毒抗原,增加免疫系統(tǒng)識別和殺傷感染細胞的能力,還可作為免疫佐劑參與機體的免疫反應,其抗病毒作用弱于Ⅰ型干擾素。白細胞介素18(interleukin-18,IL-18)是由單核巨噬細胞分泌,IL-18能夠誘導IFN-γ基因表達,也可誘導諸如TNF-α、IL-2及GM-CSF等多種細胞因子的產生和表達,在細胞免疫過程中發(fā)揮著重要作用。以往關于鴨干擾素與白細胞介素的研究,主要是針對單個干擾素或白介素,將鴨IFN-α、IFN-γ和IFN-α、IL-18進行串聯(lián)表達后,其聯(lián)合抗病毒的效果尚不清楚。本研究應用重疊延伸PCR(gene splicing by overlapextension,SOE-PCR)的方法,分別將鴨IFN-α、IFN-γ及IFN-α、IL-18基因進行融合,利用BL21原核表達系統(tǒng)進行表達,分別在體內和體外檢測融合蛋白的生物學活性,并與單個鴨IFN-α、IFN-γ和IL-18重組蛋白進行生物學活性比較,目的在于研究出易于生產,成本低,活性高,具有疊加抗病毒功能的重組復合抗病毒制劑。具體分為4個部分:1.本研究參照GenBank上發(fā)表的鴨IFN-α、IFN-γ和IL-18基因序列分別設計了3對引物,以抽提的鴨外周血淋巴細胞DNA為模板,分別擴增出去除信號肽后的目的基因。應用SOE-PCR的方法分別將鴨IFN-α、IFN-γ及IFN-α、IL-18基因進行融合,然后,將各基因連接到pET-32a(+)原核表達載體上,構建出鴨IFN-α、IFN-γ、IL-18、IFNα-IFNγ和IFNα-IL18基因的原核表達載體。2.將各重組質粒轉化至BL21原核表達系統(tǒng)中進行原核表達。將存在于包涵體中的表達蛋白用尿素變性后,使用鎳親和層析的方法純化蛋白,后利用梯度透析法進行復性,并進行SDS-PAGE分析和Western blot鑒定。3.采用微量細胞病變抑制法在VSV(水泡性口炎病毒)/DEF、AIV(禽流感病毒)/DEF及DPV(鴨瘟病毒)/DEF系統(tǒng)上檢測原核表達蛋白rDuIFNα-DuIFNγ和rDuIFNα-DuIL18的抗病毒活性,同時以rDuIFN-α、rDuIFN-γ和rDuIL-18作為對照。結果表明:rDuIFNα-DuIFNγ和rDuIFNα-DuIL18蛋白均有顯著的抗VSV、AIV和DPV活性,在DEF上,其抗病毒活性明顯優(yōu)于單一rDuIFN-α、rDuIFN-γ和rDu IL-18重組蛋白,達到105~108 U/mg,其中,融合蛋白rDuIFNα-DuIFNγ的抗病毒活性高于rDuIFNα-DuIL18。單一重組蛋白rDuIFN-α、rDuIFN-γ和rDuIL-18中,rDuIFN-α的活性最高,達到104~105 U/mg,約為rDuIFN-γ的2~10倍,rDuIL-18的抗病毒活性最低。4.分別檢測各重組蛋白在北京鴨體內抗AIV和DPV作用。結果表明,融合蛋白rDuIFNα-DuIFNγ具有較好的抗病毒效果,可有效減少排毒,對AIV和DPV感染動物的保護率分別為100%和90%,而單一重組蛋白對感染動物的保護率多在90%以下,證明rDuIFNα-DuIFNγ可有效提高攻毒保護率,其抗病毒作用優(yōu)于單個蛋白。在北京鴨上檢測重組蛋白rDuIFN-α、rDuIL-18和rDuIFNα-DuIL18對AIV滅活疫苗的免疫增強作用,發(fā)現(xiàn)重組蛋白rDuIL-18和rDuIFNα-DuIL18具有一定的免疫增強作用,對免疫后的抗體水平和攻毒保護率有一定的提高作用。
【學位授予單位】：華南農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S834

【參考文獻】

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本文編號：1145597