本文關(guān)鍵詞：鴨IFNα-IFNγ、IFNα-IL18基因的融合表達(dá)及其生物學(xué)活性研究

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【摘要】：干擾素(interferon,IFN)是一類(lèi)在同種細(xì)胞上具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子。國(guó)際干擾素命名委員會(huì)根據(jù)干擾素的抗原特性和分子結(jié)構(gòu)的差異,將干擾素分為3個(gè)型。α干擾素(IFN-α)屬Ⅰ型干擾素,主要參與機(jī)體抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)過(guò)程。γ干擾素(IFN-γ)屬于Ⅱ型干擾素,IFN-γ可誘導(dǎo)病毒感染的細(xì)胞表達(dá)病毒抗原,增加免疫系統(tǒng)識(shí)別和殺傷感染細(xì)胞的能力,還可作為免疫佐劑參與機(jī)體的免疫反應(yīng),其抗病毒作用弱于Ⅰ型干擾素。白細(xì)胞介素18(interleukin-18,IL-18)是由單核巨噬細(xì)胞分泌,IL-18能夠誘導(dǎo)IFN-γ基因表達(dá),也可誘導(dǎo)諸如TNF-α、IL-2及GM-CSF等多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生和表達(dá),在細(xì)胞免疫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。以往關(guān)于鴨干擾素與白細(xì)胞介素的研究,主要是針對(duì)單個(gè)干擾素或白介素,將鴨IFN-α、IFN-γ和IFN-α、IL-18進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)后,其聯(lián)合抗病毒的效果尚不清楚。本研究應(yīng)用重疊延伸PCR(gene splicing by overlapextension,SOE-PCR)的方法,分別將鴨IFN-α、IFN-γ及IFN-α、IL-18基因進(jìn)行融合,利用BL21原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá),分別在體內(nèi)和體外檢測(cè)融合蛋白的生物學(xué)活性,并與單個(gè)鴨IFN-α、IFN-γ和IL-18重組蛋白進(jìn)行生物學(xué)活性比較,目的在于研究出易于生產(chǎn),成本低,活性高,具有疊加抗病毒功能的重組復(fù)合抗病毒制劑。具體分為4個(gè)部分:1.本研究參照GenBank上發(fā)表的鴨IFN-α、IFN-γ和IL-18基因序列分別設(shè)計(jì)了3對(duì)引物,以抽提的鴨外周血淋巴細(xì)胞DNA為模板,分別擴(kuò)增出去除信號(hào)肽后的目的基因。應(yīng)用SOE-PCR的方法分別將鴨IFN-α、IFN-γ及IFN-α、IL-18基因進(jìn)行融合,然后,將各基因連接到pET-32a(+)原核表達(dá)載體上,構(gòu)建出鴨IFN-α、IFN-γ、IL-18、IFNα-IFNγ和IFNα-IL18基因的原核表達(dá)載體。2.將各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行原核表達(dá)。將存在于包涵體中的表達(dá)蛋白用尿素變性后,使用鎳親和層析的方法純化蛋白,后利用梯度透析法進(jìn)行復(fù)性,并進(jìn)行SDS-PAGE分析和Western blot鑒定。3.采用微量細(xì)胞病變抑制法在VSV(水泡性口炎病毒)/DEF、AIV(禽流感病毒)/DEF及DPV(鴨瘟病毒)/DEF系統(tǒng)上檢測(cè)原核表達(dá)蛋白rDuIFNα-DuIFNγ和rDuIFNα-DuIL18的抗病毒活性,同時(shí)以rDuIFN-α、rDuIFN-γ和rDuIL-18作為對(duì)照。結(jié)果表明:rDuIFNα-DuIFNγ和rDuIFNα-DuIL18蛋白均有顯著的抗VSV、AIV和DPV活性,在DEF上,其抗病毒活性明顯優(yōu)于單一rDuIFN-α、rDuIFN-γ和rDu IL-18重組蛋白,達(dá)到105~108 U/mg,其中,融合蛋白rDuIFNα-DuIFNγ的抗病毒活性高于rDuIFNα-DuIL18。單一重組蛋白rDuIFN-α、rDuIFN-γ和rDuIL-18中,rDuIFN-α的活性最高,達(dá)到104~105 U/mg,約為rDuIFN-γ的2~10倍,rDuIL-18的抗病毒活性最低。4.分別檢測(cè)各重組蛋白在北京鴨體內(nèi)抗AIV和DPV作用。結(jié)果表明,融合蛋白rDuIFNα-DuIFNγ具有較好的抗病毒效果,可有效減少排毒,對(duì)AIV和DPV感染動(dòng)物的保護(hù)率分別為100%和90%,而單一重組蛋白對(duì)感染動(dòng)物的保護(hù)率多在90%以下,證明rDuIFNα-DuIFNγ可有效提高攻毒保護(hù)率,其抗病毒作用優(yōu)于單個(gè)蛋白。在北京鴨上檢測(cè)重組蛋白rDuIFN-α、rDuIL-18和rDuIFNα-DuIL18對(duì)AIV滅活疫苗的免疫增強(qiáng)作用,發(fā)現(xiàn)重組蛋白rDuIL-18和rDuIFNα-DuIL18具有一定的免疫增強(qiáng)作用,對(duì)免疫后的抗體水平和攻毒保護(hù)率有一定的提高作用。
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S834

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本文編號(hào)：1145597