本文關(guān)鍵詞：婆羅雙樹樣基因4慢病毒干擾載體構(gòu)建及對(duì)MGC80-3轉(zhuǎn)移潛能的影響

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【摘要】：目的人婆羅雙樹樣基因4(spalt-like transcription factor 4,SALL4)是近年來新發(fā)現(xiàn)的癌基因,具有促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用。本研究旨在構(gòu)建可誘導(dǎo)shRNA基因干擾SALL4慢病毒載體并轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞建立穩(wěn)定細(xì)胞株,探討SALL4基因沉默對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的影響。方法合成特異性靶向人SALL4基因的shRNA序列,連接入TetpLKO-puro慢病毒載體;脂質(zhì)體法介導(dǎo)重組慢病毒質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝產(chǎn)生慢病毒;收集病毒上清,轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株MGC80-3,嘌呤霉素篩選獲得陽性克隆,采用四環(huán)素(tetracycline,Tet)誘導(dǎo)shRNA表達(dá)。同時(shí)設(shè)立shRNA對(duì)照組。熒光定量RT-PCR檢測(cè)SALL4mRNA水平;蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)SALL4蛋白水平;Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;熒光定量RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡分別檢測(cè)干性指標(biāo)Oct4和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)指標(biāo)E-cadherin、Slug和Twist基因及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 PCR結(jié)果表明,SALL4shRNA序列已成功連入Tet-pLKO-puro慢病毒載體。熒光定量RT-PCR結(jié)果表明,對(duì)照組Tet-PLKO-shCtrl細(xì)胞在Tet誘導(dǎo)前后,SALL4mRNA水平分別為1.015±0.150和0.932±0.127,P=0.580;實(shí)驗(yàn)組Tet-PLKO-shSALL4細(xì)胞在Tet誘導(dǎo)前后,SALL4mRNA水平分別為1.000±0.028和0.443±0.017,P0.001。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示,SALL4蛋白與mRNA變化一致。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示,對(duì)照組Tet-PLKO-shCtrl細(xì)胞Tet誘導(dǎo)前后,遷移細(xì)胞數(shù)分別為(327±66)和(330±50)個(gè),P=0.856;Tet-PLKO-shSALL4細(xì)胞Tet誘導(dǎo)前后,遷移細(xì)胞數(shù)分別為(335±44)和(100±23)個(gè),P0.001。熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,Tet-PLKO-shSALL4細(xì)胞Tet誘導(dǎo)后,干性指標(biāo)Oct4及EMT指標(biāo)Slug和Twist mRNA水平分別為0.140±0.003、0.532±0.047和0.652±0.033,P值分別為0.001、0.008和0.035;E-cadherin mRNA水平增加至8.994±0.689,P0.001。對(duì)照組經(jīng)Tet誘導(dǎo),Oct4、Slug、Twist和E-cadherin基因表達(dá)水平分別為1.180±0.010、0.931±0.016、0.978±0.036和1.330±0.371,P值分別為0.063、0.086、0.646和0.300。蛋白質(zhì)印跡與熒光定量RT-PCR結(jié)果一致。結(jié)論成功構(gòu)建可誘導(dǎo)shRNA基因干擾SALL4慢病毒載體,并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株。Tet誘導(dǎo)SALL4shRNA表達(dá)可顯著下調(diào)SALL4基因表達(dá)水平和抑制胃癌細(xì)胞MGC80-3的遷移能力。
【作者單位】： 江蘇省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院;
【基金】：國家自然科學(xué)青年基金(81201660) 江蘇省自然科學(xué)基金(BK20141303) 江蘇省“青藍(lán)工程”項(xiàng)目 江蘇省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(JSKLM-2014-006) 鎮(zhèn)江市社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(SH2015034) 江蘇大學(xué)高級(jí)專業(yè)人才科研啟動(dòng)基金(13JDG086);江蘇大學(xué)大學(xué)生科研立項(xiàng)(14A379)
【分類號(hào)】：R735.2
【正文快照】： 中華腫瘤防治雜志,2016,23(16):1060-1066Chin J Cancer Prev Treat,2016,23(16):1060-1066胃癌是常見消化道惡性腫瘤之一,我國是胃癌高發(fā)國家,胃癌發(fā)病率和死亡率位居所有惡性腫瘤的第3位[1]。胃癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,早期難發(fā)現(xiàn),晚期難治療,近年發(fā)病具有年輕化趨勢(shì)。因此,闡明胃癌

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